水稻NADP-苹果酸酶与逆境关系的研究

【摘要】：NADP-苹果酸酶(NADP-ME)是在二价金属离子存在下催化对苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸、CO_2、NADPH反应的酶,它广泛地存在于动物、植物、细菌等生物体中,参与多种代谢,是生物体生命活动中重要的酶之一。本研究室在前期的研究中,针对我国东北地区的苏打盐碱地的碳酸盐逆境(NaHCO_3,Na_2CO_3)为研究对象,采用分子生物学手法,在碳酸盐逆境下克隆了水稻的NADP-ME_2基因(GeneBank Accession No.AB053295)。本论文以水稻(Oryza sativa L.)为材料,对水稻的NADP-ME与逆境关系做了探讨研究。目前报道水稻的NADP-ME有四种同工酶,为了深入了解各同工酶与逆境的关系,本研究对水稻NADP-ME的四种同工酶在逆境下的表达特性及差别进行了比较性研究,也探讨了在逆境下水稻的地上部与地下部NADP-ME的酶活性的变化规律。为了进一步明确NADP-ME同工酶之间特性的差异,本研究利用大肠杆菌表达体系,通过GST融合蛋白纯化了二个水稻NADP-ME蛋白,在体外对其酶的生物化学特性进行了比较研究。在酵母表达体系中表达水稻的NADP-ME基因后,初步对其抗逆性进行了探讨。主要得到了如下结果: 1、分析得到四种水稻NADP-ME同工酶之间的同源性都超过75%,氨基酸序列有较高的相似性。利用PSORT(Prediction of protein localization sites)分析的结果:NADP-ME_1在N-末端带有质体转酶肽,被预测存在于叶绿体;而NADP-ME_2、NADP-ME_3被分别预测定位于细胞膜、内质网,NADP-ME_4是定位细胞质中。我们用绿色荧光蛋白(GFP蛋白)分子标记方法在遗传转化的拟南芥中探讨了NADP-ME_2在细胞的的定位情况,结果表明,NADP-ME_2-GFP融合蛋白在遗传转化的拟南芥根细胞的细胞膜部位大量表达,这表明了NADP-ME_2在植物体中存在于细胞膜。预测及实验的结果表明水稻的NADP-ME四种同工酶存在于细胞内不同的亚细胞内起着功能,各自扮演着不同的角色。 2、用Northern杂交方法对水稻NADP-ME基因的表达特性研究。首先对水稻NADP-ME_2的表达做了解析,在正常的条件下,水稻的叶、茎中NADP-ME_2的mRNA表达量较高,而在根中则较低,NADP-ME_2基因的mRNA表达不受光的诱导,表明NADP-ME_2可能是水稻非光合型的NADP-ME。然而,水稻质体型NADP-ME_1(C_3植物质体型NADP-ME)基因的表达却受光的诱导,这些结果未见报道。在NaCl、NaHCO_3、Na_2CO_3、10%PEG逆境处理下,水稻NADP-ME_2基因的表达量明显地增高,表明水稻的NADP-ME_2基因表达与逆境存在着应答关系。用半定量RT-PCR的方法对四种水稻NADP-ME基因与逆境应答关系进行了探讨,表明水稻不同NADP-ME基因对环境逆境信号产生了不同应答反应特性。 3、通过天然活性电泳及NADP-ME特异酶活性染色方法,从水稻中检测出四种NADP-ME同工酶,这一结果和以前报道的不完全相同(在C_3植物中仅检测出一条NADP-ME特异带)。在NaHCO_3、Na_2CO_3、NaCl及PEG_(6000)逆境下,水稻NADP-ME特异酶活性都明显的增高,从蛋白表达水平上进一步表明了水稻的NADP-ME与逆境存在着显著的应答关系。