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《东北林业大学》 2008年
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西伯利亚蓼3-磷酸甘油醛脱氢酶的cDNA克隆及耐盐性分析

李晓泽  
【摘要】: 本研究根据NaHCO_3胁迫下的西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)消减文库中的ETS序列,利用RACE技术,克隆出3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的全长cDNA序列,命名为Ps GAPDH。通过生物信息学方法进行了初步的分析;利用Northern杂交技术对NaHCO_3不同胁迫时间下的地下茎、茎及叶的表达模式进行研究;将该基因构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,INVScI)表达载体pYES2,进行酿酒酵母的遗传转化,对转基因酵母的耐盐性进行了研究。主要实验结果如下: (1)Ps GAPDHcDNA序列全长1331 bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。氨基酸序列分子量为36.672 kDa,理论pI值是7.66,蛋白不稳定系数是24.31,属于稳定蛋白。氨基酸同源性比对显示草本植物西伯利亚蓼的GAPDH与其它草本植物的GAPDH基因同源序列相似性较高,最高达到96%;与落叶灌木也具有高的同源性,最高达到93%;且它与其它物种中存在于细胞质的GAPDH基因的氨基酸序列同源性高达96%。推测此基因属于胞质中的GAPDH基因。蛋白比对显示该基因编码蛋白有2个保守的功能域,一个为行使糖运输和代谢的GAPDH功能域;另一个是NAD(P)结合功能域。 (2)Northern印记杂交检测显示,NaHCO_3胁迫处理的西伯利亚蓼的地下茎、茎及叶片具有不同的表达模式。在叶部胁迫4-24 h过程中,Ps GAPDH表达减少,表现受抑制,48 h后趋于正常。而在茎部在2-8 h,随着胁迫时间的增加表达量增加,表现为诱导,而随后的24-48 h胁迫后表达量趋于正常。而在地下茎中,Ps GAPDH的表达量有微弱的增强。 (3)将Ps GAPDH基因与酵母表达载体pYES2连接,获得了pYES-GAPDH重组质粒。将pYES-GAPDH质粒转化到酵母菌INVScI中。随机挑选3个INVScI(pYES-GAPDH)单菌落,经PCR扩增和提取菌液质粒双酶切证明Ps GAPDH基因已构建到pYES2载体上;对INVScI(pYES-GAPDH)和INVScI(pYES2)菌株进行半乳糖诱导,RTPCR证明该基因已经在酵母中成功表达,对转基因酵母进行NaHCO_3和NaCl胁迫。结果表明,INVScI(pYES-GAPDH)重组酵母与INVScI(pYES2)相比,在10%NaHCO_3和4mol·L~(-1) NaCl胁迫下具有较高的存活率。说明,来源于西伯利亚蓼的GAPDH基因赋予酵母细胞一定的抗盐能力,表现出抗逆性的功能。
【学位授予单位】:东北林业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q943.2

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