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《东北林业大学》 2010年
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木豆叶中具有雌激素样活性的黄酮类成分提取分离及其抗肿瘤活性研究

刘威  
【摘要】: 本论文建立了高效、快速、准确测定木豆叶中黄酮类成分的分析方法;考察了木豆幼苗生长过程中和采收后木豆叶储藏过程中黄酮类成分的含量变化;研究了负压空化提取黄酮类成分的工艺条件;用pER8-GFP转基因拟南芥对木豆叶提取物及其不同组分进行了雌激素样活性的研究,确定了活性组分为乙酸乙酯层;用反相ODS中压柱层析结合重结晶技术分离纯化了乙酸乙酯层中的黄酮类成分;继续用pER8-GFP转基因拟南芥对纯化得到的黄酮类成分进行雌激素样活性筛选,确定雌激素样活性成分为cajanol;并对cajanol进行了抗肿瘤活性的初步研究。 1.建立了LC-MS/MS同时分离检测木豆叶中黄酮类成分的方法。 色谱条件:HiQ SiL C18V反相柱(250 mm×4.6 mm I.D.),流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液,流速0.7 mL/min,进样量10μL,柱温30℃。 多反应监测(MRM)离子对:芹菜素m/z 269.0→117.0、木犀草素m/z 284.8→133.0、异鼠李素m/z 315.1→151.0、牡荆苷m/z 431.0→283.0、异牡荆苷m/z 431.0→283.0、荭草苷m/z 447.3→327.0、cajanol m/z315.1→178.9、染料木苷m/z 431.3→268.0。 在负离子模式下,对木豆叶中黄酮类成分进行了CID-MS/MS分析,首次实现了8种黄酮类成分的分离、鉴定及定量。本方法选择性强、灵敏度高、精密度高,适用于木豆叶及其它植物中黄酮类成分的分析检测。 2.研究了木豆幼苗生长过程中及采收后木豆叶储藏过程中黄酮类成分的含量变化,结果表明: (1)牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷主要在木豆叶中积累,在茎和根中的含量较低;染料木苷主要在木豆根中积累;芹菜素、木犀草素、异鼠李素、cajanol在木豆幼苗的叶、茎和根中均有分布,在3个部位中含量相当。综合考虑8种黄酮类成分的含量,木豆叶是黄酮类成分的主要积累部位,真叶出现后的第40 d左右为最佳采收期。木豆的茎和根也可做为黄酮类成分的来源。 (2)在木豆叶采收后冷藏过程中,室温(25℃)条件下黄酮类成分的含量在120 d内稳定增加,但增幅不明显;冷藏温度(4℃)下黄酮类成分的含量在第45 d达到最高值,之后锐减。 上述结果揭示了采收前后的因素对木豆中黄酮类成分的影响趋势。 3.设计了负压空化提取装置用于木豆叶中黄酮类成分的高效提取。考察了液固比、提取时间、空气流量、压力、提取次数等因素对负压空化提取过程中黄酮类成分提取率的影响,确定了最佳工艺参数: 液固比:10:1(mL/g) 提取时间:20 min 空气流量:30 mL/min 压力:-0.04--0.05 Mpa 提取次数:3次 提取溶剂:70%乙醇 在上述条件下,芹菜素、木犀草素、异鼠李素、牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、cajanol和染料木苷的提取率均达到95%以上。 在负压空化提取过程中,空气在负压条件下通入提取装置,微小气泡与液滴、固体颗粒形成气-液-固三相体系,在其溃灭产生的巨大能量的推动下,三相平衡破坏,加大了目标成分、固体颗粒及溶剂之间的相互作用,从而使目标成分快速从固体颗粒中分离进入提取溶剂中,提高了传质速率和提取效果。 4.用pER8-GFP转基因拟南芥对木豆叶提取物及其4个不同组分进行了雌激素样活性研究,结果如下: (1)木豆叶提取物在大于200μg/mL浓度下,表现出较强的雌激素样活性; (2)在木豆叶提取物的4个组分中,乙酸乙酯层在100μg/mL浓度下即可观察到较强的绿色荧光,活性最强;其次是石油醚层,400μg/mL浓度下具有弱雌激素样活性;正丁醇层和水层在400μg/mL浓度下没有雌激素样活性。乙酸乙酯层是其活性组分。 pER8-GFP转基因拟南芥筛选方法灵敏、高效,适用于雌激素样活性组分的确定及雌激素样活性指导分离实验。 5.进行了木豆叶提取物乙酸乙酯层中黄酮类成分的分离纯化研究: (1)确定了芹菜素、木犀草素、异鼠李素和cajanol的反相ODS中压柱层析条件: 25%乙腈-水体系梯度洗脱,流速1.5 mL/min.经过ODS柱层析纯化后,芹菜素、木犀草素、异鼠李素、cajanol纯度分别可达92.98%、93.51%、92.42%和91.56%,收率为78.93%、83.12%、75.62%和77.96%。 (2)确定了牡荆苷、异牡荆、苷荭草苷和染料木苷的反相ODS中压柱层析条件: 20-30%甲醇-水体系梯度洗脱,流速1.5 mL/min.经过ODS柱层析纯化后,牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、染料木苷纯度分别可达93.12%、92.39%、91.67%和90.37%,收率为81.33%、84.00%、80.14%和78.24%。 6.用pER8-GFP转基因拟南芥对木豆叶提取物乙酸乙酯层中纯化得到的8种黄酮类成分的雌激素样活性进行了研究。 cajanol在50μM浓度下即可诱导较高水平的GFP蛋白表达,雌激素样活性最好,是主要的活性成分。染料木苷在大于200μM浓度下具有较强的雌激素样活性,芹菜素在400μM浓度下具有弱雌激素样活性,而木犀草素、异鼠李素、牡荆苷、异牡荆苷和荭草苷没有活性(400μM)。 pER8-GFP转基因拟南芥适用于木豆及其它植物中雌激素样活性成分的筛选。 7.研究了cajanol对PC-3前列腺癌细胞的作用,得到如下结果: (1)Cajanol可以抑制PC-3前列腺癌细胞的生长,并且随着时间的延长和剂量的增加,存活率逐渐下降,抑制增殖效果增强,呈剂量和时间依赖性。用cajanol作用PC-3细胞24、48和72 h时,IC50分别为23.9、16.2和12.2μg/mL; (2) Cajanol (5-15μg/mL)作用PC-3前列腺癌细胞48 h,可以引起PC-3细胞G2/M期阻滞,使肿瘤细胞不能顺利进行增殖; (3) Cajanol可以抑制ERα和ERβ的表达,用15μg/mL cajanol处理PC-3前列腺癌细胞48 h后,ERα和ERβ的相对表达量分别为39.73±2.36%和73.12±2.33%。ER表达下调可降低雌激素的促肿瘤细胞增殖作用。
【学位授予单位】:东北林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R284;R285

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