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《黑龙江中医药大学》 2011年
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刺五加水煎液改善睡眠作用的机制研究

董梅  
【摘要】:目的:探讨刺五加水煎液改善睡眠作用的机制; 方法: 1.增强阈下剂量戊巴比妥钠作用实验 末次给药30 min后,各组均腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠(45mg/kg),提起小鼠尾巴,将小鼠腹部朝上放在温暖(37。C)的垫块上。以翻正反射消失时间记为睡眠潜伏时间,以翻正反射消失的持续时间记为睡眠时间。 2.刺五加水煎液改善睡眠作用的量效关系研究 将实验动物随机分为7组,对照组和6个不同剂量刺五加水煎液组即(4,8,1 6,32,64,128g/kg),经灌胃途径给药,给药组分别给予相应剂量刺五加水煎液,对照组给予同体积的蒸馏水,连续7天,按照增强阈下剂量戊巴比妥钠作用实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 3.刺五加水煎液改善睡眠作用的时效关系研究 在刺五加水煎液改善睡眠作用的量效关系研究的基础上,将实验动物分为6组,对照组和5个不同给药时间组(3days、5days、7days、9days、lldays),经灌胃途径给药,给药组给予剌五加水煎液32g/kg,对照组给予同体积蒸馏水,按照增强阈下剂量戊巴比妥钠作用实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 4.刺五加水煎液联合Flumazenil对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为6组,每组10只,分别为空白组、刺五加水煎液组、刺五加水煎液+氟马西尼组、地西泮组、地西泮+氟马西尼组、氟马西尼组。灌胃给予蒸馏水或刺五加水煎液溶液(1.6g/ml,32g/kg),连续灌胃7天,地西泮(0.25mg/ml,2.5mg/kg)灌胃给予1次,氟马西尼(0.lmg/ml, 3.5mg/kg)于注射戊巴比妥钠前20 min注射,按照增强阈下剂量戊巴比妥钠作用实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 5.刺五加水煎液对小鼠大脑皮质GABA受体基因表达的影响 在上述实验表明BZD受体介导刺五加水煎液改善睡眠作用的基础上,将实验动物随机分3组,每组6只,分别为刺五加组(1.6g/ml,32g/kg)、空白组(给予同体积蒸馏水)、地西泮组。经灌胃途径给药,连续灌胃7天,地西泮组(125 mg/ml,2.5 mg/kg)灌胃给予1次,空白组、刺五加组于末次给药(水)30 min后,地西泮组于灌胃给药后20 min后,断头处死,冰浴上取皮质。采用荧光半定量RT-PCR技术,观察刺五加水煎液对GABAA受体a1和a5亚单位的mRNA表达的影响。 6.刺五加水煎液联合5-HTP对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为4组,分别为空白组、刺五加水煎液组、刺五加水煎液+5-HTP组、5-HTP组。刺五加水煎液组经灌胃给予阈下剂量(0.4g/ml,8g/kg),空白组经灌胃给予同体积蒸馏水,两组均连续灌胃7天,5-HTP(2.5mg/ml,25mg/kg)于腹腔注射戊巴比妥钠前15 min经腹腔注射,按照增强阈下剂量戊巴比妥钠作用实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 7.刺五加水煎液联合PCPA对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为4组,分别为空白组、刺五加水煎液组、刺五加水煎液+PCPA组、PCPA组。刺五加水煎液组经灌胃给予(1.6g/ml,32g/kg),空白组经灌胃给予同体积蒸馏水,两组均连续灌胃7天,PCPA组(30mg/ml, 300mg/kg)于腹腔注射戊巴比妥钠前24h皮下注射,按照增强阈下剂量戊巴比妥钠作用实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 8.刺五加水煎液对小鼠全脑DA含量的影响 将实验动物随机分2组,每组10只,分别为空白组和刺五加水煎液组。灌胃给予蒸馏水或刺五加水煎液组经灌胃给予药液(32g/kg),空白组经灌胃给予同体积蒸馏水,连续灌胃7天,各组均与末次给药(水)30min后,断头处死,冰浴上剥离全脑,称重。采用酶联免疫吸附法,观察刺五加水煎液对小鼠全脑DA含量的影响 9.SCH23390对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为5组,每组10只,分别为空白组和4个不同剂量SCH23390组(7μg/kg,21μg/kg,70μg/kg,210μg/kg).经皮下注射途径给药,给药组分别给予相应剂量SCH23390,空白组皮下注射相同体积空白溶剂,所有各组给药15min后,按照增强阈下剂量戊巴比妥钠实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 10.刺五加水煎液联合SCH23390对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为4组,每组10只,分别为空白组、刺五加水煎液组、刺五加水煎液+SCH23390组、SCH23390组。经灌胃途径给予蒸馏水或阈下剂量刺五加水煎液(0.4g/ml,8g/kg),连续灌胃7天,在腹腔注射戊巴比妥钠前15 min皮下注射阈下剂量SCH23390(0.7μg/ml,7μg/kg),按照增强戊巴比妥钠实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 11. Haloperidol对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为5组,每组10只,分别为空白组和4个不同剂量Haloperidol组(0.7mg/kg,2.1mg/kg,7mg/kg,21mg/kg).经灌胃途径给药,空白组灌胃空白溶剂,其余四组分别灌胃不同浓度的Haloperidol,按照增强阈下剂量戊巴比妥钠实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 12.刺五加水煎液联合Haloperidol对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为4组,每组10只,分别为空白组、刺五加水煎液组、刺五加水煎液+Haloperidol组、Haloperidol组。刺五加水煎液经灌胃给予阈下剂量(0.4g/ml,8g/kg),空白组经灌胃途径给予相同体积蒸馏水,连续灌胃7天,Haloperidol(0.07mg/ml,0.7mg/kg)于腹腔注射戊巴比妥钠前15 min经灌胃途径给药,按照增强阈下剂量戊巴比妥钠实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 13.刺五加水煎液对小鼠全脑NO含量与TNOS活力的影响 将实验动物随机分2组,每组10只,分别为对照组和刺五加水煎液组(1.6g/ml,32g/kg).经灌胃途径给药,对照组给予相同体积蒸馏水,连续灌胃7天,末次给药(水)30min后,断头处死,冰浴上剥离全脑,称重。用冷的蒸馏水研磨,4℃15 000 r离心20min,取上清液,化学比色法测定NO含量及TNOS活力。 14.L-Arg对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为5组,每组10只,分别为空白组和4个不同剂量的L-Arg组(125mg/kg,250mg/kg,500mg/kg,1000mg/kg),经腹腔注射途径给药,L-Arg组给予不同浓度的L-Arg.按照增强阈下剂量戊巴比妥钠实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 15.刺五加水煎液联合L-Arg对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为4组,每组10只,分别为空白组、刺五加水煎液组、刺五加水煎液+L-Arg组、L-Arg组。经灌胃途径分别给予蒸馏水或阈下剂量刺五加水煎液溶液(0.4g/ml,8g/kg),连续灌胃7天,在腹腔注射戊巴比妥钠15min前,经腹腔注射途径给予阈下剂量L-Arg(12.5mg/ml,125mg/kg),按照增强阈下剂量戊巴比妥钠实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 16. L-NAME对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为5组,每组10只,分别为空白组和不同剂量L-NAME组(10mg/kg,20mg/kg,40mg/kg,80mg/kg).经腹腔注射途径给药,分别腹腔注射不同剂量的L-NAME。按照增强阈下剂量戊巴比妥钠实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 17.刺五加水煎液联合L-NAME对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 将实验动物随机分为4组,每组10只,分别为空白组、刺五加水煎液组、刺五加水煎液+L-NAME组、L-NAME组。经灌胃途径分别给予蒸馏水或刺五加水煎液(1.6g/ml,32g/kg),连续灌胃7天,在腹腔注射戊巴比妥钠15min前腹腔注射L-NAME(8mg/ml,80mg/kg),按照增强阂下剂量戊巴比妥钠实验,分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 18.刺五加水煎液对小鼠全脑P物质含量的影响 将实验动物随机分为2组,每组10只,分别为空白组和给药组。经灌胃途径给药,空白组给予等体积蒸馏水,给药组给予刺五加水煎液(1.6g/ml,32g/kg),连续灌胃7天,两组均于末次给药(水)30min后,断头处死,冰浴上剥离全脑,称重。用冷的蒸馏水研磨,4℃3000r离心20min,取上清液,酶联免疫吸附法测定小鼠全脑P物质含量。 19.刺五加水煎液对小鼠全脑OrexinA含量的影响 将实验动物随机分为2组,每组10只,分别为对照组和给药组。经灌胃途径给药,对照组给予等体积蒸馏水,给药组给予刺五加水煎液(1.6g/ml,32g/kg),连续灌胃.7天,两组均于末次给药(水)30min后,断头处死,冰浴上剥离全脑,称重。用冷的蒸馏水研磨,4℃3000r离心20min,取上清液,酶联免疫吸附法测定小鼠全脑OrexinA含量。 20.刺五加水煎液对小鼠全脑IL-1β含量的影响 将实验动物随机分2组,每组10只,分别为空白组和给药组。经灌胃途径给药,空白组给予等体积蒸馏水,给药组给予刺五加水煎液(1.6g/ml, 32g/kg),连续灌胃7天,两组均于末次给药(水)30min后,断头处死,冰浴上剥离全脑,称重。用冷的蒸馏水研磨,4℃3000r离心20min,取上清液,酶联免疫吸附法测定小鼠全脑工L-1β的含量。 21.刺五加水煎液对小鼠全脑TNF-α含量的影响 将实验动物随机分2组,每组10只,分别为空白组和给药组。经灌胃途径给药,空白组给予等体积蒸馏水,给药组给予刺五加水煎液(1.6g/ml, 32g/kg),连续灌胃7天,两组均于末次给药(水)30min后,断头处死,冰浴上剥离全脑,称重。用冷的蒸馏水研磨,4℃3000 r离心20min,取上清液,酶联免疫吸附法测定小鼠全脑TNF-α的含量。 结果: 1.刺五加水煎液改善睡眠作用的量效与时效关系研究 刺五加水煎液起效剂量为16g/kg,在剂量范围内,随剂量增大,睡眠时间延长,到128g/kg效果不再增加,存在一定剂量依赖关系。与对照组比较,刺五加水煎液能明显增加试验动物的睡眠时间(P0.05,P0.0 1);其中,刺五加水煎液剂量为32g/kg时,可缩短戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠潜伏期(与对照组比较,P0.05)。 刺五加水煎液催眠作用的起效天数为连续灌胃5天,至11天效果不再增加,表现一定的时间依赖性;其中,连续灌胃刺五加水煎液7天效果最为显著(与对照组比较,P0.01),缩短睡眠潜伏期(与对照组比较,P0.05)。 2.刺五加水煎液改善睡眠的机制研究 1)刺五加水煎液联合Flumazenil对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 苯二氮口类受体阻断剂氟马西尼明显减弱刺五加水煎液对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的增强作用(p0.01)。 刺五加水煎液组与空白组比较,小鼠大脑皮质GABAA受体a1亚单位和a5亚单位的mRNA表达明显升高(P0.05)。 2)刺五加水煎液联合5-HTP、PCPA对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 阈下剂量的刺五加水煎液合并5-HT前体物质5-HTP应用后,明显延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间,表现一定协同作用(P0.01)。 PCPA可以明显缩短戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠持续时间(与空白组比较p0.05)。给予阈上剂量刺五加水煎液后,能明显拮抗PCPA的作用(p0.05),同时PCPA可缩短刺五加水煎液的催眠作用(p0.05)。 3)刺五加水煎液联合SCH23390对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 阈上剂量刺五加水煎液,与空白组比较,小鼠全脑DA含量无显著性差异(P0.05)。 多巴胺D1受体拮抗剂SCH23390具有一定的催眠作用,有效浓度为70μg/kg,主要表现为显著延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间(与空白组比较,P0.01)。 SCH23390可延长刺五加水煎液对小鼠睡眠的持续时间(P0.01)和缩短睡眠的潜伏期(P0.01)。 与空白组比较,多巴胺D2受体拮抗剂Haloperidol具有一定的催眠作用,起效剂量为7mg/kg,主要表现为显著延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间(P0.01)和缩短睡眠潜伏期(P0.01)。 Haloperidol可明显延长刺五加水煎液对小鼠睡眠的持续时间(P0.01)和缩短睡眠的潜伏期(P0.01)。 4)刺五加水煎液对小鼠全脑NO含量与TNOS活力的影响 刺五加水煎液与空白组比较,明显减少小鼠全脑NO的含量(P0.05),而对小鼠全脑的TNOS影响无显著性差异(P0.05)。 5) L-Arg对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 在一定剂量范围内,随着剂量增加,L-Arg表现出一定的催眠作用,起效剂量为500mg/kg,主要表现为显著延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间(与空白组比较,p0.01)。剂量为1000mg/kg时,表现为显著延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠潜伏期(与空白组比较,p0.01)。 阈下剂量的刺五加水煎液合并NO前体物质L-Arg应用后,与各组比较,均能明显延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间,表现一定协同作用(P0.01)。 6) L-NAME对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响 实验结果表明,与空白组比较,L-NAME (40mg/kg或80mg/kg)能明显增强戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠实验,表现为延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠持续时间(p0.05,p0.01)和缩短其潜伏期(p0.01)。 NOS拮抗剂L-NAME,可明显拮抗刺五加的催眠作用(与刺五加组比较,P0.05;与L-NAME组比较,P0.01)。7)刺五加水煎液对小鼠全脑P物质和OrexinA含量的影响 刺五加水煎液能明显降低小鼠全脑的SP含量(与空白组比较,P0.05)。 刺五加水煎液能明显降低小鼠全脑的OrexinA含量(与空白组比较,P0.05)。8)刺五加水煎液对小鼠全脑IL—1β和TNF-α含量的影响 刺五加水煎液能明显降低小鼠全脑的IL-1β含量(与空白组比较,P0.05)。 刺五加水煎液能明显降低小鼠全脑的TNF-α含量(与空白组比较,P0.05)。 结论: 1、实验结果表明,刺五加水煎液起效剂量为16g/kg,在一定剂量范围内,具有催眠作用,随剂量增大,睡眠时间延长,存在一定剂量依赖关系。其中,刺五加水煎液剂量为32g/kg效果最为显著。 2、刺五加水煎液催眠作用的起效天数为连续给药5天,且连续灌胃7天与戊巴比妥钠协同作用最显著; 3、GABA能神经系统介导刺五加改善睡眠作用:刺五加水煎液改善睡眠作用通过上调苯二氮口类受体发挥作用,与DZ作用相似; 4、刺五加水煎液改善睡眠作用依赖于5-HT的存在。 5、刺五加水煎液连续给药7天不能明显改变小鼠全脑中DA含量,但DA受体D1和D2拮抗剂影响刺五加水煎液改善睡眠作用;DA神经系统参与介导刺五加水煎液改善睡眠作用,其机制有待于进一步研究。 6、NO信号通路介导刺五加水煎液改善睡眠作用,刺五加水煎液可降低脑内NO水平; 7、SP介导刺五加水煎液改善睡眠作用:刺五加水煎液通过降低全脑内SP含量发挥改善睡眠作用;刺五加水煎液通过降低全脑内OrexinA含量发挥改善睡眠作用; 8、细胞因子介导刺五加改善睡眠作用:刺五加水煎液可降低全脑工L-1 0和TNF-α含量。刺五加水煎液通过调节细胞因子改善睡眠的作用还有待于进一步研究。 综合以上研究结果表明,刺五加水煎液通过以上多靶点作用机制改善睡眠。
【学位授予单位】:黑龙江中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5

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