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《黑龙江中医药大学》 2015年
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基于伏邪、络病理论探讨经痛愈舒颗粒对EMs大鼠 EphA2、(P)P38MAPK、VEGF和MVD的影响

马遇春  
【摘要】:研究目的1.建立中医病证结合寒凝血瘀型EMs大鼠模型,应用该模型动态观察EMs异位内膜的外观变化、病理形态学变化、血液流变学及凝血功能变化,确定EMs大鼠药物干预的时间点。2.探讨EMEs“伏寒伤肾,致瘀损络”的中医病机,在此基础上进一步深入探讨EMs中西医病机结合点“瘀阻络脉”与“血管生成”的关系,并检测EphA2、(P)P38MAPK、VEGF和微血管密度(MVD)在EMs大鼠异位内膜和正常子宫内膜中表达的差异,探讨四者与EMs发生的关系。3.观察经痛愈舒颗粒治疗性干预EMs大鼠后异位内膜的病理形态学变化,检测EphA2、(P)P38MAPK、VEGF和MVD表达的变化,大鼠实验室血液指标的变化,探讨经痛愈舒颗粒治疗寒凝血瘀型EM s的作用机制。4.比较经痛愈舒颗粒预防性干预和治疗性干预寒凝血瘀型EMs的结果,探讨预防性干预对EMs发病的影响及作用机制。研究方法1.实验一:将雌性未交配大鼠30只随机分为空白对照组4只、模型组26只。模型组采用自体子宫内膜移植和冰水浸泡复合法建立寒凝血瘀型EMs模型,分别于造模后3天、5天、4周、6周、8周各随机取4只,观察大鼠表征、病灶外观,取异位内膜行HE染色作病理学观察,腹主动脉取血做血液流变学和凝血功能检测,结果与空白对照组大鼠正常子宫内膜病理形态和血液检测结果作对比。2.实验二:将雌性未交配大鼠100只随机分为空白对照组12只、模型组88只。模型组建立寒凝血瘀型EMs模型,于术后4周开腹探查,取造模成功大鼠72只随机分为模型4周组、模型8周组、经痛愈舒颗粒低、中、高剂量组和西药组各12只。模型4周组直接处死;各用药组连续4周按相应药物灌胃;模型8周组和空白对照组连续4周用生理盐水灌胃;所有大鼠于灌胃4周后处死。所有大鼠处死之前取血作血液流变学和凝血功能检测,取病灶组织(空白对照组取正常子宫内膜),HE染色做病理学观察,RT-PCR和Western Blot检测组织中EphA2mRNA和蛋白的表达情况;免疫组化法检测组织中EphA2、(P)P38MAPK和VEGF的表达,用CD31标记血管内皮细胞对组织的MVD计数判断组织的血管生成能力,确定经痛愈舒颗粒的最佳用药剂量。3.实验三:将雌性未交配大鼠60只随机分为空白对照组12只、模型组48只。模型组建立寒凝血瘀型EMs模型,于术后5日随机开腹探查,将确定种植成功的12只分为预防组,于术后5日起连续4周给予最佳剂量经痛愈舒颗粒灌胃,并于术后1周加入冰水浸泡法;剩余大鼠于术后4周开腹探查,将确定成模的大鼠中随机取12只为模型4周组、12只为中高组。模型4周组直接处死;中高组连续4周经痛愈舒颗粒灌胃后处死;空白对照组连续4周生理盐水灌胃后处死。所有大鼠检测项目同实验二。研究结果1.实验一结果显示,寒凝血瘀型EMs大鼠造模成功率为76.9%。病理观察异位组织,可见造模3天时严重水肿,间质细胞少;造模5天时水肿减轻但结构较松散;造模4周时已形成典型子宫内膜形态:造模6周及8周时与造模4周时相似。模型组大鼠出现寒邪致病表征,血液流变性和凝血功能出现异常,各模型组之间血液指标的比较无明显差异。2.实验二结果显示,寒凝血瘀型EM s大鼠造模成功率为86.4%。用药后各中药组大鼠寒凝血瘀外观及精神状态有所好转,西药组基本无变化且明显体重增加。各治疗组病灶体积缩小,中高组和西药组最明显。各治疗组异位内膜病理观察出现不同程度的生长受抑现象,尤以中高组与西药组变化最明显。中药各组大鼠的血液流变性和凝血功能出现显著改善,西药组与模型组相比没有变化。3.RT-PCR和Western blot吉果显示,与空白对照组比较,各模型组和各治疗组中EphA2mRNA和蛋白的表达明显升高;与模型4周组比较,EphA2在模型8周组的表达明显升高,在各治疗组中的表达明显降低,并且在中高组的表达低于西药组,EphA2mRNA和蛋白表达一致。4.免疫组化结果显示,与空白对照组比较,EphA2、(P)P38MAPK、VEGF和MVD在各模型组和治疗组的表达明显升高;与模型4周组比较,四者在模型8周组的表达明显升高,在各治疗组的表达明显降低,在中高组的表达明显低于西药组。Spearman相关分析显示,EphA2与(P)P38MAPK、VEGF. MVD在异位内膜中的表达呈正相关。5.实验三结果显示,寒凝血瘀型EMs大鼠造模成功率为85.4%。预防组大鼠未出现明显寒凝血瘀外观,预防组、中高组病灶明显变小,与周围组织粘连减轻。病理结果显示预防组用药对异位内膜的生长抑制作用强于中高组;血液流变性和凝血功能检测结果显示预防组与中高组无明显差异。6.RT-PCR和Western blot结果显示,EphA2mRNA和蛋白在中高组的表达低于在预防组的表达。免疫组化结果显示,IphA2、(P)P38MAPK.VEGF在中高组的表达明显低于预防组,预防组MVD的数目明显低于中高组。Spearman相关分析显示,EphA2与(P)P38MAPK.VEGF.MVD在异位内膜中的表达呈正相关。研究结论1.自体子宫内膜移植和冰水浸泡复合法可成功建立寒凝血瘀型EMs大鼠模型。2.“伏寒伤肾,致瘀损络”为EMs的中医病机,“瘀阻络脉”与“血管生成”的密切关系为EMs中西医病机结合点3.EphA2mRNA和蛋白在EMs大鼠异位内膜中的表达明显高于在正常子宫内膜的表达,EphA2的表达与异位内膜中(P)P38MAPK. VEGF和MVD表达呈正相关,提示EphA2的异常表达可能参与了EM s的发病机制。4.经痛愈舒颗粒可明显抑制EMs大鼠异位内膜的生长,显著降低组织中EphA2. (P)P38MAPK. VEGF的表达和MVD的数目,在改善寒凝血瘀型EMs大鼠血液流变学和凝血功能、改善“寒邪表征”、无明显副作用方面强于西药达那唑。5.EMs发病过程中,EphA2可能通过对EphA2→P38MAPK→VEGF通路的调控作用影响了EMs异位内膜组织的血管生成能力。6.经痛愈舒颗粒预防性用药对EMs大鼠异位内膜的抑制作用优于治疗性用药,支持经痛愈舒颗粒对EMs未病先防、愈后防复的目的。
【学位授予单位】:黑龙江中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R285.5

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【参考文献】
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