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《黑龙江中医药大学》 2016年
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红花多糖对人舌鳞癌HN-6细胞干预作用机制的研究

周海燕  
【摘要】:目的:探讨红花多糖(safflowerpolysaccharide,SPS)在体内、外干预人舌鳞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)HN-6 细胞增殖、诱导凋亡及相关基因和蛋白表达的影响。为探索低毒、高效干预治疗人舌鳞癌的中医药提供理论和实验依据。方法:体外实验:1、运用CCK-8比色法检测不同浓度的SPS和顺铂在不同时间对人舌鳞癌HN-6细胞生长情况的干预作用。2、采用倒置显微镜观察SPS对细胞形态学改变;并运用AO/EB双色荧光染色观察红花多糖和顺铂对人舌鳞癌HN-6细胞凋亡的影响。3、流式细胞术(FCM)检测应用SPS干预后人舌鳞癌HN-6细胞周期中的各时相细胞比例的变化和对细胞凋亡的影响。4、Western blot 检测经 SPS 干预后细胞中 Cleaved caspase-3、COX-2,Bcl-2及Bax蛋白表达情况。5、实时定量PCT(QRT-PCR)法检测SPS对细胞内Cleaved caspase-3、COX-2,Bcl-2 及 BaxmRNA 表达水平的影响。体内试验:1、人舌鳞癌HN-6细胞构建裸鼠移植瘤模型。成瘤后随机分为模型组、顺铂组(5mg/kg)SPS 高浓度组(80mg/kg)、SPS 中浓度组(40mg/kg)、SPS低浓度组(20mg/kg)实验组,共3组,每组5只。实验组每天在近肿瘤处背部皮下局部组织注射,给药计量为0.8ml/d,1次/d,连续给药20d,每天观察裸鼠的饮食、活动及精神状况。并且每周(w)测量瘤体大小及裸鼠的体重。结束时处死小鼠,剥离取得肿瘤组织称重并计算抑瘤率。2、应用QRT-PCR技术检测移植瘤中COX-2,Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3mRNA表达情况,并对检测结果进行半定量分析,进一步了解SPS抑制人舌鳞癌细胞移植瘤的情况。3、采用 Westernblot 方法检测移植瘤中 Cleavedcaspase-3、COX-2,Bcl-2及Bax的蛋白表达情况,并对检测结果进行半定量分析,进一步探讨SPS抑制舌癌细胞移植瘤增殖及其促进细胞凋亡的机制。结果体外试验1、CCK-8比色法显示红花多糖和顺铂对人舌鳞癌HN-6细胞的增殖有不同程度的抑制作用,与空白对照组相比差异有统计学意义(P0.05),红花多糖抑制作用随着时间增加作用增强,在一定浓度内,随着浓度的升高作用增强,呈现一定的量效关系,当在0.64mg/ml时,抑制作用最为明显。2、应用倒置显微镜观察红花多糖和顺铂作用24h后显示:HN-6细胞增殖变慢,贴壁细胞减少,细胞间隙增大、且部分细胞变圆、体积缩小、核染色质致密,一些细胞胞膜呈空泡状、胞浆中颗粒明显增多,部分漂浮在培养液中、部分细胞崩解破裂,且有凋亡小体形成。随着SPS浓度的增加,上述变化更加明显。3、采用AO/EB双色荧光染色检测,结果红花多糖和顺铂具有诱导人舌鳞癌HN-6细胞凋亡的作用;经流式细胞仪检测,HN-6细胞经0.64mg/ml SPS作用48h后,其早期凋亡率、细胞坏死或晚期凋亡率显著增加,G0/G1期细胞比例明显增加,而S期细胞所占比例降低。4、Western blot检测发现,SPS作用后的HN-6激活了 Cleaved caspase-3凋亡表达机制,Bcl-2及COX-2蛋白表达量减少,相反Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达增加,与空白对照组相比较差异具有统计学意义。5、QRT-PCR实验发现实验组与空白对照组均存在COX-2,Bcl-2及Bax mRNA的表达,比较对照组,Bcl-2及COX-2mRNA表达量减少,Bax和Cleaved caspase-3 mRNA表达量增加,与空白对照组相比较有显著性差异。体内试验1、与模型组相比,红花多糖组及顺铂对照组肿瘤生长缓慢,随着SPS给药时间的增长,肿瘤被抑制效果更加明显;各组裸鼠移植瘤体积、瘤质量均存在显著性差异(P0.05)。2、瘤质量及瘤体积抑制率达到45.65—51.72%;整个治疗过程中,裸鼠未见明显不良反应,治疗结束时,各组裸鼠体质量与治疗前体质量相比增加平稳,比值大于0.8,未见明显毒性反应。3、光学显微镜下显示:实验组及顺铂、对照组(模型组)肿瘤内组织坏死崩解的面积明显大于对照组,细胞形态的异形性比对照组小,可见核固缩等凋亡现象。4、Western blot方法检测移植瘤中COX-2,Bcl-2的蛋白表达下调,Bax和Cleaved caspase-3的蛋白表达上调,有统计学意义(P0.05)。5、QRT-PCR技术检测移植瘤中有COX-2,Bcl-2基因表达下调,Bax和Cleaved caspase-3mRNA表达上调,具有统计学差异(P0.05);结论1.红花多糖能够抑制人舌鳞癌HN-6细胞及人舌鳞癌移植瘤的增殖,并在一定浓度内,随着浓度的升高作用不断增强,呈现一定的量效关系。2.红花多糖能够促进人舌鳞癌HN-6细胞及人舌鳞癌移植瘤的凋亡。3.红花多糖能够调控人舌鳞癌HN-6细胞周期,主要表现为细胞周期阻滞在G0/G1期。4.红花多糖可下调人舌鳞癌HN-6细胞及人舌鳞癌移植瘤COX-2、Bcl-2 mRNA表达,上调Cleavedcaspase-3、Bax mRNA表达。红花多糖可下调COX-2、Bcl-2蛋白表达,上调Bax和Cleavedcaspase-3蛋白表达。
【学位授予单位】:黑龙江中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R285

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