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《黑龙江中医药大学》 2017年
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夹脊电针对ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠腰髓运动神经元自噬相关蛋白影响的实验研究

郭颖  
【摘要】:目 的:通过夹脊电针干预ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠,观察其对小鼠疾病进程、行为学及其对腰髓前角运动神经元形态学的影响,以自噬相关蛋白表达为作用靶点,探讨电针夹脊穴干预肌萎缩侧索硬化取效的可能作用机制,为夹脊电针治疗ALS提供实验依据。方法:第一部分夹脊电针对ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠疾病进程和行为学的影响:1.ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠的鉴定:本实验以ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠为实验对象,于小鼠日龄30天时,应用美国Jackson实验室提供的引物序列和方案对小鼠进行PCR鉴定,并根据病情进展观察小鼠的表型特征。2.分组及处置:ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠30只,按随机数字表法随机分为电针组、手针组、模型组各10只,于小鼠日龄60天开始干预,电针组针刺双侧L_(1-2)、L_(5-6)夹脊穴,躯干同侧2Hz电针治疗;手针组针刺双侧L(1-2)、L(5-6)夹脊穴;模型组予以捆绑固定。20min/次,2次/W,共4W。3.神经功能评分及行为学测试:联合应用悬尾试验、称重、转棒实验来观察小鼠发病及疾病进展情况。第二部分夹脊电针对ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学的影响:1.分组及处置:ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠24只,按随机数字表法随机分为电针组、手针组、模型组各8只,同窝野生型小鼠8只作为阴性对照。电针组、手针组、模型组处置同第一部分,阴性对照组处置同模型组。小鼠日龄120天时取腰膨大进行检测2.HE染色和尼氏染色观察腰髓前角运动神经元形态及计数。3.电镜观察腰髓前角运动神经元超微结构变化。第三部分夹脊电针对ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠腰髓自噬相关蛋白的影响:1.分组及处置:选用经PCR鉴定的ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠18只,按照随机数字表法将小鼠随机分为电针组、手针组和模型组(均n=6只)。取同窝野生型小鼠6只作为阴性对照组。电针组、手针组、模型组、阴性对照组处置同第一部分。2.采用免疫组化法检测腰髓组织中hSOD1、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达。3.采用Western Blot检测腰髓组织中hSOD1、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达。结果:1.ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠的鉴定:PCR鉴定:出现两个条带的泳道对应的受检小鼠为SOD1~(G93A)转基因小鼠,仅出现一个条带的泳道对应的受检小鼠为同窝野生型小鼠,阳性率为40%± 5%。表型特征:小鼠于日龄90天左右出现悬尾时后肢震颤或伸展无力,100~120天左右出现行动缓慢及后肢拖拽,140~150天左右小鼠完全瘫痪,不能爬行和自主进食,侧卧于垫料上。2.体质量分析:与模型组比较,电针能明显延缓小鼠体质量丢失,有显著性差异(P0.05),手针组小鼠体质量丢失亦得到一定的延缓,但无统计学意义(P0.05)。3.发病时间和生存期分析:模型组、手针组、电针组小鼠发病时间分别为(94.2±6.89)d、(99.2±4.96)d、(102.0±8.80)d,与模型组相比,仅电针组具有统计学意义(P0.05);与手针组相比,电针组小鼠发病时间虽有所推迟,但无显著性差异(P0.05)。模型组、手针组、电针组小鼠生存期分别为(141.8±4.29)d、(146.8±6.53)d、(152.3±4.74),与模型组相比,手针组和电针组均具有显著性差异(P0.05,P0.01);与手针组相比,电针组小鼠生存期明显延长,具有显著性差异(P0.05)。4.转棒实验分析:与模型组比较,从19周和21周,手针组和电针组小鼠转棒运动功能明显得到改善(P0.05,P0.01),且电针组改善更明显(P0.05,P0.01)。5.形态学:①HE染色可见模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少,神经元胞体结构不清、固缩,胞质胞核染色不清,核固缩,出现空泡状改变;与模型组比较,手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目增多,神经元胞体结构形态有所改善,空泡化减少,且电针组效果优于手针组。②运动神经元计数:模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少(P0.01);手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组增多(P0.05,P0.01),且电针组较手针组增多更明显(P0.05)。③透射电镜可见模型组小鼠腰髓前角神经元胞体萎缩,细胞膜皱缩,线粒体不同程度肿胀,嵴出现断裂、减少,有些线粒体虽可辨认,但已呈空泡状,核膜凹陷变形或部分破裂,异染色质聚集成块,变性的神经元胞体周围可见胶质细胞围绕形成卫星现象;与模型组比较,手针组和电针组小鼠腰髓前角神经元胞体超微结构有所改善,且电针组改善更明显。6.夹脊电针对ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠腰髓hSOD1的影响:免疫组化染色结果显示,模型组小鼠腰髓前角hSOD1的表达显著上调(P0.01);与之相比较,手针组和电针组hSOD1的表达显著下降(P0.05,P0.01),且电针组较手针组下降更明显(P0.05)。免疫印迹结果显示,模型组小鼠腰髓hSOD1蛋白表达增加(P0.01);与之相比较,手针组和电针组hSOD1蛋白表达显著减少(P0.01),且电针组较手针组下降更加显著(P0.01)。7.夹脊电针对ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠腰髓LC3-Ⅱ影响:免疫组化染色结果显示,模型组小鼠腰髓前角LC3-Ⅱ的表达显著上调(P0.01);与之相比较,手针组和电针组LC3-Ⅱ的表达显著升高(P0.05,P0.01),且电针组优于手针组(P0.05)。免疫印迹结果显示,模型组小鼠腰髓LC3-Ⅱ蛋白表达增加(P0.01);与模型相比较,手针组和电针组LC3-Ⅱ蛋白表达显著增加(P0.01),且电针组较手针组升高更加显著(P0.01)。8.夹脊电针对ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠腰髓Beclin1影响:模型组小鼠腰髓前角Beclin1蛋白表达水平明显上调(P0.01);与之相比较,手针组和电针组小鼠腰髓Beclin1蛋白表达水平显著升高(P0.05,P0.01),且电针组优于手针组(P0.05)。免疫印迹结果显示,模型组小鼠腰髓Beclin1蛋白表达增加(P0.01);与模型相比较,手针组和电针组Beclin1蛋白表达显著增加(P0.01),且电针组较手针组升高更加显著(P0.01)。结论:1.夹脊电针能够改善ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠的运动功能,延缓发病时间,延长生存期。2.夹脊电针可以减少ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠腰髓前角运动神经元丢失。3.夹脊电针可以上调ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠腰髓前角运动神经元自噬功能。4.夹脊电针治疗ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠可能是下调hSOD1的表达。5.夹脊电针治疗ALS-SOD1~(G93A)转基因小鼠的机制可能是直接抑制hSOD1的表达,通过上调LC3-Ⅱ、Beclin1的表达,加强自噬功能,促进细胞内异常蛋白清除,起到保护运动神经元的作用。
【学位授予单位】:黑龙江中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R245

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