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《黑龙江中医药大学》 2017年
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补肾生精方对腺嘌呤诱导的肾阳虚型少弱精大鼠模型作用机制的实验研究

樊金卿  
【摘要】:目的:通过观察补肾生精方对少弱精大鼠模型睾丸、附睾组织质量、精液质量、血清性激素水平及转化生长因子-β超家族的细胞内信号内转导分子Smad1、Smad4基因在大鼠睾丸中表达的影响,探讨补肾生精方对腺嘌呤诱导的肾阳虚型少弱精大鼠模型作用机制,为临床治疗提供有效的科学依据。方法:将120只成熟的12周龄的SD雄性大鼠适用性饲养一周后,将其随机分为模型组、空白组、高剂量组、中剂量组、低剂量组、西药对照组共6组,每组各20只。将腺嘌呤配成浓度为500mg/mL的混悬液,除空白组大鼠给予生理盐水灌胃外,其余各组均给予腺嘌呤进行灌胃,每日灌胃1次,共灌胃28天,造成肾阳虚型少弱精子症大鼠模型,每组取出2只大鼠,用免疫组化法检测睾丸及附睾组织造模是否成功。造模成功后,高、中、低剂量组分别给予不同剂量的补肾生精方灌胃治疗,灌胃剂量分别为高剂量组为5.52g/100g体重、中剂量组为2.76g/100g体重、低剂量组为1.38g/100g体重,而模型组和空白组每日均给予1mL/100g体重的生理盐水灌胃,西药对照组每日给予10ml/kg体重的左卡尼汀注射液灌胃,每组均连续灌胃28天。实验过程中观察大鼠一般状态(如毛色、活动、体态等),测日饮水量及进食量。实验结束后将大鼠全部处死,股动脉取血、分离血清、摘取睾丸、性腺及附属性腺称重,提取附睾精液。采用计算机辅助精子质量分析系统检测大鼠的精子密度、精子活动率、前向运动精子百分率;检测大鼠的体重、睾丸及附睾的质量;免疫组化法(SABC法)检测大鼠睾丸中Smad 1、Smad 4的水平;采用放免法检测各组大鼠的血清性腺激素睾酮(T)及黄体生成素(LH)水平、卵泡刺激素(FSH);采用实时荧光定量PCR法检测大鼠睾丸中Smad 1、Smad 4的定位和分布;Western Blot检测大鼠睾丸中Smad 1、Smad 4的水平及采用酶免法检测大鼠血清肝肾功能。结果:1.精子计数和精子活动力检测结果比较 空白组与模型组相比,差异显著具有统计学意义(P0.05),与模型组相比,高剂量组、中剂量组、低剂量组、西药对照组各药物治疗组精子计数和精子活动力显著提高,差异显著具有统计学意义(P0.05),高剂量组精子计数和精子活动力明显高于中剂量组、低剂量组、西药对照组,差异显著具有统计学意义(P0.05),而中剂量组与西药对照组比较差异无统计学意义(P0.05)2.补肾生精方对肾阳虚型大鼠性腺及附属性腺组织的影响 与空白组相比,其他各组大鼠体重均明显下降,差异显著具有统计学意义(P0.05),与模型组相比,高剂量组、中剂量组、西药对照组明显增高,差异显著具有统计学意义(P0.05),低剂量组与模型组相比无明显差异(P0.05),中剂量组与西药对照组相比无明显差异(P0.05)。与空白组相比,各组大鼠睾丸湿重与附睾湿重均降低,差异显著具有统计学意义(P0.05),与模型组相比,高剂量组、中剂量组、西药对照组大鼠睾丸湿重与附睾湿重均升高,差异显著具有统计学意义(P0.05),低剂量组与模型组相比无明显差异(P0.05),中剂量组与西药对照组相比无明显差异(P0.05)。3.免疫组化发检测各种Smad1、Smad4表达情况空白组及模型组中Smad1、Smad4在大鼠睾丸的各级生精细胞中均有表达,Smad1免疫反应阳性物质位于细胞质内,细胞核内为阴性,间质细胞及支持细胞均未见阳性表达;Smad4免疫反应阳性物质位于细胞核内,细胞质内为阴性,支持细胞、间质细胞及其他各级生精细胞均未见阳性表达。与模型组相比,其余各组Samd1的表达明显降低,差异显著,具有统计学意义(P0.05),高剂量组Samd1的表达明显低于中剂量组、低剂量组、西药对照组,差异显著具有统计学意义(P0.05),而中剂量组与西药对照组差异无统计学意义(P0.05);与模型组相比,其余各组Samd4的表达明显升高,差异显著,具有统计学意义(P0.05),高剂量组Samd4的表达明显高于中剂量组、低剂量组、西药对照组,差异显著具有统计学意义(P0.05),而中剂量组与西药对照组差异无统计学意义(P0.05),4.各组动物血清中性激素水平检测比较分析 模型组中血清睾酮(T)水平降低,LH、FSH水平升高;而高、中、低剂量组血清睾酮(T)水平升高,LH、FSH水平降低,且高剂量组明显优于中、低剂量组,差异显著具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,其余各组血清睾酮(T)水平,LH、FSH水平均有显著性差异,具有统计学意义(P0.05)。5.各组大鼠睾丸中Smad1、Smad4mRNA半定量RT-PCR表达情况 在各组大鼠睾丸中,均可见到Smad1、Smad4的mRNA表达,其中在模型组中Smad1的mRNA表达被抑制,Smad4的mRNA表达上调,而自拟补肾生精方高剂量组中Smad 1的mRNA表达被上调,Smad4的mRNA的表法被抑制。6.酶免疫法检测肾脏功能情况 通过解剖观察各组大鼠肾脏组织外观、病理组织学检查及超微结构进行观察均无明显改变,且血清检查亦无明显改变,说明自拟补肾生精方治疗肾阳虚型少弱精不育大鼠安全可靠,无明显不良反应。结论:1.补肾生精方能够有效增加精液密度,有效提高精子的活率及活力,并通过调节睾酮的分泌,增加睾丸及附属性腺的质量,使生精环境得到改善。2.补肾生精方能够促进大鼠生长代谢以及大鼠睾丸及附睾组织的发育。3.补肾生精方治疗后能促进下丘脑-垂体分泌和调节促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)释放,提高睾酮(T)浓度,降低雌二醇(E2)含量,调节下丘脑-垂体-睾丸轴功能,改善性腺轴的功能紊乱。4.补肾生精方通过调控大鼠睾丸中TGF-β超家族的细胞内信号转导分子Smads基因的表达,其可明显增加Smad1在肾阳虚型少弱精大鼠睾丸中的表达,降低Smad4在肾阳虚型少弱精大鼠睾丸中的表达,且能够上调Smad1的mRNA表达,抑制Smad4的mRNA的表达,说明Smads在肾阳虚型少弱精大鼠模型中起到了重要的作用,直接或间接促进精子的生成。5.通过酶免疫法检测各组大鼠血清中肾功能均无显著变化,证明补肾生精方治疗肾阳虚型少弱精不育大鼠安全可靠,无明显不良反应。
【学位授予单位】:黑龙江中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285.5;R-332

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