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转大豆WRKY基因烟草后代的鉴定及生理特性研究

刘林娟  
【摘要】:WRKY家族是近年来发现的一类植物特有的转录因子,广泛参与植物对生物与非生物胁迫应答反应,在生物胁迫、防卫反应信号分子、干旱、低温、创伤和重金属等不同的环境胁迫条件下能被诱导表达,参与植物新陈代谢、果实成熟、种皮和毛状体发育以及衰老等一系列生理活动。 本研究以分别转入大豆WRKY基因家族中的HY1和HY5基因的烟草T1代种子为试验材料,对转基因烟草子代进行抗生素筛选、PCR和RT-PCR检测,研究外源基因在子代间遗传的稳定性,并对盐胁迫下的转基因烟草T2代进行生理指标的检测,为HY1和HY5基因的功能研究提供参考,为今后利用大豆WRKY基因培育其它抗逆植物奠定基础,对植物抗逆机理的研究也具有一定的理论意义。主要研究结果如下: 将转HY1基因和转HY5基因的烟草T1种子经过无菌处理后,接种于不含激素的固体MS培养基(附加3%蔗糖、0.7%琼脂,pH 5.8)中,获得T1代转基因烟草幼苗,出芽率分别为56.6%和56.4%。一周后转入MS+50mg/L Kan培养基中筛选抗性植株。采用CTAB法提取转HY1基因和转HY5基因T1代和T2代植株总DNA,设置未转化植株为阴性对照,经PCR检测,转HY1基因烟草植株获得600bp目的条带,转HY5基因烟草植株获得530bp目的条带,与预期相符。 用异硫氰酸胍法提取T2代转化植株叶片总RNA,以HY1和HY5基因特异引物分别对T2代植株总RNA进行RT-PCR扩增,设置未转化植株为阴性对照,结果转HY1基因烟草植株获得600bp目的条带,转HY5基因烟草植株获得约530bp目的条带,与预期相符。 经不同浓度NaCl处理后,对转基因烟草T2代植株POD、SOD活性和可溶性蛋白含量进行了检测。POD、SOD活性均随胁迫浓度增加,呈现先升高后降低的趋势。两种转基因烟草的POD活性在100mmol/L达到最大。转HY1基因烟草T2代植株SOD活性和可溶性蛋白含量在50mmol/L NaCl浓度时达到最大值,转HY5基因烟草T2代植株的SOD活性在150mmol/L时达到最大值,可溶性蛋白含量在100mmol/L时达到最大值。以上三个指标均比未转基因对照植株提高,表明转HY1基因和HY5基因的烟草抗盐胁迫能力有所提高。


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