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《牡丹江师范学院》 2017年
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SLA-Ⅰ复合体的构建及PRRSV M蛋白CD8+T细胞表位的筛选

江新杰  
【摘要】:猪白细胞抗原(SLA)基因具有高度的多态性,与猪传染性疾病和疫苗引起的免疫应答密切相关。经典SLA Ⅰ类分子表达于所有有核细胞表面,其功能是参与内源性抗原的递呈。SLA Ⅰ类分子高度多态的α1和α2区域共同构成了病毒抗原肽结合槽,能够递呈抗原肽至CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),并将其激活进而杀死感染的靶细胞,从而诱导宿主产生特异性细胞免疫应答。由于SLA-Ⅰ与病毒T细胞表位结合是CD8+T淋巴细胞清除感染细胞的第一步,并且SLA对抗原表位具有严格的限制性,因此研究SLA Ⅰ类分子的多态性对于阐明SLA-Ⅰ与病毒CTLs表位相互作用的分子机制具有重要的科学意义。本研究利用RT-PCR SBT方法对加系SPF长白猪SLA-1基因进行扩增,共获得5个SLA-1等位基因,其多态性主要集中在第2外显子和第3外显子,通过比较第2和第3外显子所编码的α1和α2功能域,发现获得的5个SLA-1等位基因在构成抗原肽结合槽6个口袋(A-F)的33个关键氨基酸中,有10个完全保守氨基酸位点,分别是5(L)、7(Y)、59(Y)、81(L)、84(Y)、123(Y)、146(K)、159(Y)、160(L)、171(Y),其余23个位点均发生不同程度突变。而该种突变可能影响抗原肽结合槽口袋大小,从而导致不同SLA-1等位基因型对同一T淋巴细胞表位结合能力的差异。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重阻碍养世界养猪业发展的病原。有研究表明,PRRSV感染后能够诱发机体产生体液和细胞免疫应答,其中细胞兔疫在机体清除PRRSV感染方面有可能起着更为重要的作用。CTL是机体有效控制各种病毒感染的重要免疫细胞之一。受MHC Ⅰ类分子限制性抗原的特异性CTL反应是机体受到病毒感染时,控制病毒复制和扩散、清除病毒的主要机制。M蛋白、N蛋白和GPS蛋白是PRRSV的3个重要结构蛋白,其中M蛋白为PRRSV的膜基质蛋白,也是最为保守的结构蛋白,M蛋白具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性细胞免疫应答,在细胞免疫中起重要作用。因此本研究以PRRSV M蛋白为研究对象,预测与SLA Ⅰ类分子具有潜在结合能力的10个候选T细胞表位。利用剪接重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术体外构建长白猪上获得的5个SLA-1基因胞外区和β2m的复合体,将其与预测的10个候选CTLs表位串连,利用原核表达系统进行表达,纯化和复性,建立ELⅠSA检测方法筛选PRRSV M蛋白SLA-1不同等位基因限制性CD8+CTL候选表位。本研究成功构建不含表位pET-SLA-1*X-Linker-β2m复合体5个,含有表位pET-epitope-SLA-1*X-Linker-β2m复合体46个。并发现预测的不同PRRSV M蛋白T细胞表位可与不同SLA-1等位基因发生特异性结合,与SLA-1*07:02发生特异性结合的M1、M2、M5和M8表位;与SLA-1*08:01特异性结合的M4、M6、M7和M9表位;以及与SLA-1*13:01特异性结合的M2、M4、M6和M10表位。
【学位授予单位】:牡丹江师范学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651

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