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《牡丹江师范学院》 2017年
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应用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制抗PVY烟草种质的研究

潘洪杏  
【摘要】:为敲除与PVY侵染相关的eIF4E-6基因,建立烟草PVY抗性定向改良技术体系。本研究构建了2个特异靶向eIF4E-6基因的CRISPR-Cas9载体g1和g2,经烟草转化、转化子PCR检测、靶序列测序,获得靶位点突变烟株24株,并对突变株进行抗病鉴定。主要结果如下:1.PVY侵染相关靶向基因的确定将PVY病毒属侵染相关的辣椒、番茄、豌豆、莴苣等的eIF4E或eIF(iso)4E基因在烟草基因组数据库中blast序列比对,选择与这些植物的感PVY eIF4E或eIF(iso)4E基因同源关系最近的烟草eIF4E-6基因家族成员作为CRISPR/Cas9靶向基因。2.eIF4E-6基因靶点筛选依据eIF4E-6基因序列,设计多个CRISPR/Cas基因组编辑靶标位点。烟草基因组数据库内搜索与靶位点序列(20bp)相似的同源序列,剔除有同源序列可与靶位点序列的识别区域(PAM序列:NGG上游16bp)相匹配的靶标位点,并应用Cas9/gRNA体外酶切靶点DNA片段,评估gRNA靶点活性。选择2个特异性强切割活性高的gRNA靶标点用于eIF4E-6基因CRISPR/Cas9基因敲除载体构建。3.CRISPR/Cas9基因敲除载体构建合成靶序列正义链及反义链的寡核苷酸片段(oligo),5’端分别加接头,退火形成带有接头序列的oligo二聚体,将oligo二聚体与CRISPR/Cas9空载体的连接产物采用热激转化DH5a感受态细胞,经菌落PCR和测序验证,证实eIF4E-6基因CRISPR/Cas9表达载体构建成功。4.烟草的遗传转化叶盘法转化烟草品种K326,获得T0代再生植株256株,潮霉素抗性基因PCR扩增筛选出102株阳性植株。其中g1阳性转化株45株,g2阳性转化株57株。5.目标基因编辑效果分子检测用引物eIF4EMutF和eIF4EMutR对潮霉素抗性基因阳性植株PCR扩增。扩增产物测序。并与eIF4E-6基因原序列进行比对,得到g1突变株14株,其中2株核苷酸缺失突变,13株核苷酸替换突变;g2突变株10株,全部为核苷酸替换。
【学位授予单位】:牡丹江师范学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2

【参考文献】
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