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多种肿瘤标志物联合诊断新技术的研究

李欢  
【摘要】:肿瘤标志物在临床上已应用了许多年,为癌症的诊断和疗效观察提供了有效的信息,但在临床应用过程中,单指标检测模式存在着特异性不强、阳性率低等不足。因此临床上常联合几项相关的标志物,同时对某一疾病进行检测,来提高诊断的准确性。在生物分析中传统的高密度多孔板筛选技术仍是现今的主流,但随着人们对微载体高效、简便、多功能性等性能认识的不断深入,基于各种微载体的检测技术得到了人们越来越多的关注。目前基于微载体的检测方法得到了一定的商业开发,具有很高的应用前景,并且可以有效降低仪器成本和每次的检测费用,但是也存在着如何提高编码数量、简化解码过程、提高检测速度和准确性等方面的问题。这些问题的解决有待于新型编码方法的出现、新的编码-解码策略的发明以及计算机辅助手段的进步等。本课题即是结合微载体、化学发光和荧光标记物,实现多组分的同时检测,以期为临床疾病的诊断、监测提供简便有效的新方法。 本课题主要包括四个部分:第一章综述了目前多组份检测技术的进展,并列举了近年来它在各个分析领域的部分典型示例。第二章使用585nm、655nm和525 nm三种量子点,建立了三种肿瘤标志物(CEA、NSE与Ferritin)的均相检测新技术。实验步骤为:结合有CEA. NSE或Ferritin的包被抗体聚苯乙烯微球复合物,先与样品中抗原结合,再与三种检测抗体反应,最后加入三种量子点标记物;抽滤洗涤后,直接进行荧光测定,得出CEA、NSE与Ferritin的浓度。本方法具有以下特点:(1)采用三种不同发射波长的量子点作为标记物,一次实验即可实现三个标志物的同时检测;(2)与以往方法相比,不仅缩短了检测时间,而且有效地减少了实验操作步骤;(3)量子点之间无光谱干扰,三种肿瘤标志物之间也无交叉干扰。然而,进一步的研究发现:当不同发射波长的量子点波长间隔小于40nm时,不同量子点之间将产生一定的光谱重叠,必须采用光谱解析的方法才能进行各个标志物的准确测定。我们考虑到商品化的96孔板荧光化学发光扫描仪,既可测定荧光又可测定化学发光的特性,因此在第三章中,我们构建了偶合荧光和化学发光标记物的多组分检测新技术。本章采用一种量子点(605nm)和两种酶——碱性磷酸酯酶(ALP)和辣根过氧化物酶(HRP)为标记物,实现了三种肿瘤标志物(NSE、CEA和Cyfra 21-1)的同时检测。实验步骤为:首先NSE、CEA和Cyfra 21-1包被抗体聚苯乙烯微球复合物与样品中抗原反应,再与三种检测抗体结合,最后与量子点、ALP和HRP三种标记物同时反应,顺序测定荧光和化学发光,得出NSE、CEA和Cyfra 21-1的浓度。本章首次提出了化学发光酶与量子点联合测定肿瘤标志物的新方法,经实验验证酶与量子点之间无相互干扰,同时NSE、CEA和Cyfra 21-1之间也无交叉干扰,是一种可有效提高标志物数目的技术。为更进一步提高检测速度,缩短检测时间,第四章建立了快速检测血清样品中CEA和NSE的方法。实验步骤为:生物素化的CEA和NSE包被抗体先与抗原和检测抗体结合,然后加入作为捕获载体的链霉亲和素聚苯乙烯微球,再加入两种标记物量子点(525nm和655nm),最后量子点经解离后直接进行荧光测定得出CEA和NSE的浓度。本实验中包被抗体、抗原和检测抗体实现了部分的“一锅煮”反应,各步的反应时间可缩短至15min,整个反应过程的时间可控制在1 h内。反应结束后,将量子点从聚苯乙烯微球上解离下来再进行测定,可有效地减少聚苯乙烯微球的自发荧光,使实验结果更加准确。 本文构建的方法均采用微米级、颗粒度均匀、表面羧基修饰的聚苯乙烯微球,经共价交联固定包被抗体或链霉亲和素作为捕获载体,既可离心沉淀洗涤,也可采用96孔过滤板抽滤洗涤,实现了多组分的均相反应、异相分离,更有利于实现自动化操作。同时采用不同荧光波长的量子点之间无光谱干扰,且能被同一波长激发的优点,很好地实现了三种肿瘤标志物的同时检测;进而利用商品化的96孔板荧光化学发光扫描仪既可测定荧光又可测定化学发光的特性,构建了偶合荧光和化学发光标记物的多组分检测新技术;最后利用“一锅煮”反应构建了快速的两组份检测新技术。综上所述,本文建立的多组分测定方法只需要一次检测,即可完成以往需要多次才能完成的测定任务,显著地减少了检测时间,可以有效降低仪器成本和检测费用。此外,通过引入更多的标记物,如:量子点,酶或胶体金等,还可以进一步增加分析物的数目,提高检测的灵敏度。本文的方法以其简便易行、快速可靠、灵敏度高、易于实现自动化等特点,为多组分分析方法提供了有价值的选择方案,有望在环境监测、临床诊断、食品安全、药物分析与微生物检验等领域得到广泛的应用。


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