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PCLA-PEG-PCLA温致水凝胶的合成、多肽包裹与修饰及其医学应用

张正  
【摘要】:可注射性水凝胶材料在再生医学领域有良好的应用前景。水凝胶的含水量和模量等基本性质与人体的软组织接近,而且它们注射使用的植入方式能与“微创”技术结合,有利于减轻病患痛苦和加快术后愈合。其中,由聚乙二醇和可降解聚酯组成的嵌段聚合物水凝胶材料,由于其可降解吸收性和温致凝胶化的特点近年来受到研究者较多的关注;由于材料凝胶化过程不涉及化学反应,且其高分子嵌段的基本组成是FDA所批准过的医用材料,因此有望具备良好的生物相容性和安全性,使其更有希望获得临床应用。近年来有研究报道将聚乙二醇和聚酯所组成的嵌段聚合物温致水凝胶作为药物缓释载体,但其作为组织修复材料的研究还相对很少。后者还需要考虑细胞在材料上的黏附、降解产物对创面愈合的影响等更为复杂的问题。 本博士论文针对聚醚—聚酯嵌段共聚物温致物理水凝胶体系在可注射性组织工程材料方面的潜在应用开展了高分子材料方面的基础研究,在此过程中我们还尝试了该材料在防止术后粘连方面的应用。论文试图将高分子科学、合成化学、生物医用材料与临床医学交叉融合,工作涉及了从材料制备到医学应用前期工作的多个方面。 论文以亲水的聚乙二醇(PEG)和疏水的可降解聚酯(PCLA)所组成的三嵌段共聚物(PCLA-PEG-PCLA)作为主要的高分子研究对象,研究内容包括聚合物和多肽的合成、水凝胶制备、溶胶-凝胶转变性能的调控、凝胶材料的生物相容性和体内外降解行为的评价、多肽生物活性分子的包裹与修饰、以及在预防术后肠粘连和作为可注射性组织工程材料这两个方面的潜在医学应用等部分。本论文的主要创新性工作包括以下几方面: 1.合成了降解产物酸性相对较低的、可物理凝胶化的无定形PCLA-PEG-PCLA嵌段共聚物。本论文通过开环聚合,合成了一系列中间为聚乙二醇、两端为疏水聚酯的三嵌段聚合物。通过调整疏水聚酯链段的长度等,将聚合物水溶液的凝胶转变温度控制在室温和体温之间,使其呈现“室温溶胶、体温凝胶”的可注射凝胶特性,为未来临床应用带来了便利。通过己内酯(CL)与丙交酯(LA)的无规共聚,一方面降低了单纯使用PLA作为疏水嵌段而导致的使用过程中酸性降解产物的副作用,另一方面也避免了仅使用PCL作为疏水嵌段所引起的材料由结晶而导致的储存过程中提前物理凝胶化的问题。 2.验证了所合成聚合物的体内外生物相容性、并发现相应的物理水凝胶具有良好的凝胶保持特性和适宜的可降解性。为了研究材料基本的生物相容性和生物安全性能,我们按照国家标准“医疗器械生物学评价”的相关要求设计了体外的细胞毒性实验,证实材料对细胞黏附和增殖无显著影响;通过相关的动物实验证实了材料在使用时不会引起明显的溶血和热原反应;同时对体内植入部位的组织进行切片染色和组织学分析,证实了材料在体内良好的生物相容性,没有出现可见的组织病变和严重的炎症反应。通过体外模拟生理条件,研究了材料的降解行为,发现凝胶在体外能维持近12周,分子量呈线性下降,不同于聚酯材料通常所见的自催化所导致的指数下降特性;将材料埋植于新西兰兔皮下,发现材料在动物体内降解加快,可能是体内的一些酶的参与加速了聚酯的降解,但是体内存在时间仍然可达到6周,比Pluronic等传统的物理水凝胶的保持时间(通常1天左右)长一个数量级以上。 3.首次尝试PCLA-PEG-PCLA温致物理水凝胶在术后防粘连方面的应用,并在动物实验中获得成功。外科手术中的组织粘连是一个十分普遍的问题,防止术后粘连十分重要。由两亲性嵌段聚合物胶束自组装而形成的该物理凝胶,其表面富集了大量的亲水的PEG链段。PEG能有效抵抗蛋白和细胞的黏附,因此,我们推测,该聚合物有望作为一种防粘连材料,并且我们的温敏凝胶可以通过注射的方式植入体内,能与腹腔镜、关节镜等微创医疗手段相结合。通过合作研究,我们利用新西兰兔的腹壁和盲肠损伤模型,将水凝胶注射植入创面,起到了隔离作用。动物实验结果证明:水凝胶在使用便利性和预防组织粘连上的效果上都明显优于市售的PLA膜材料,并且凝胶良好的生物相容性不会影响术后创面的愈合。这样,我们首次将该嵌段共聚物物理凝胶尝试用于防止术后粘连,并且在方便操作的同时,起到了良好的动物实验效果。 4.发现在水凝胶中包裹促进细胞黏附的多肽不仅不会妨碍术后粘连,还会显著增强术后防粘连的效果。本文还利用了水凝胶对小分子的缓释特性,将具有与细胞特异性相互作用的多肽cyclo(-RGDfK-)包裹其中,发现可实现一周左右的持续释放;而在术后粘连发生的过程中,炎症细胞的迁移和黏附是粘连组织形成的重要步骤,其发生的时间一般集中在术后一周内。动物实验结果发现,我们的水凝胶缓释多肽分子能进一步抑制术后组织粘连的发生;水凝胶释放RGD多肽的实验组与单纯使用凝胶或多肽相比,在预防粘连上的效果更好。RGD多肽固定于材料表面能够促进细胞向材料黏附,但未固定的RGD分子能在释放以后与材料外部的细胞上的整合素结合,占据细胞上整合素结合位点,反而抑制了这些细胞向材料的黏附。 5.首次对于PCLA-PEG-PCLA的不同嵌段平行进行多肽修饰、并发现嵌段共聚物的多肽修饰具有显著的位置效应。上述水凝胶的另外一个潜在应用方向为组织工程材料,这类温致物理凝胶化的现象提供了极好的可注射性材料的特性。可是作为一种组织工程材料,细胞黏附性不佳是其瓶颈;与防粘连材料中包裹游离多肽不同,这里需要将多肽共价连接到嵌段聚合物中,就涉及到如何连接以及到底向那个嵌段连接更好的问题。为此我们通过Fmoc保护法固相合成一种能与细胞膜上的整合素发生特异结合的活性多肽分子cyclo(-RGDfK-),并且为了进一步将多肽化学固定在水凝胶上,我们又合成了一种非对称的光敏偶联分子,其-端的叠氮基团能通过紫外光引发与聚合物中的PEG发生插入反应,另一端羧基经NHS活化后,能与多肽的氨基发生偶合反应。在建立上述合成基础平台的基础上,本博士论文在国际上首次平行地将多肽分子化学连接到两亲性聚合物的亲水嵌段和疏水嵌段。我们还进一步比较了两种不同连接方式所制备的聚合物材料与细胞相互作用时的效果差异。研究证明,对于两亲性嵌段聚合物而言,生物活性分子固定在亲水链段能更好地起到促进细胞黏附的作用。上述工作在提供了医用高分子的修饰技术的同时,也部分揭示了医用高分子修饰的设计原理。 除了可注射性材料以外,博士论文期间还对PLGA多孔支架进行了初步研究,制备了一种双层支架,为进一步研制作为复合组织缺损修复的相应的组织工程材料打下了基础。


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