酪氨酸激酶受体EphB2在胰腺癌生物学特性中的功能定位及清胰化积方干预研究

【摘要】：背景：酪氨酸激酶受体(Receptor Tyrosine Kinase，RTK)在恶性肿瘤生物学特性调控中发挥重要作用,EphB2属于酪氨酸激酶受体Eph (Erythropoietin-producing hepatoma cell line，Eph receptors)家族中的一员。我们前期研究发现,在胰腺癌SW1990肝高转移株建立过程中,EphB2发生了显著改变,此外,多项研究也证实EphB2与恶性肿瘤进展相关,有研究显示其发挥抑癌基因作用,也有研究显示其发挥癌基因作用,但EphB2与胰腺癌的关系却未见报道,值得研究。中医药治疗恶性肿瘤历史悠久,具有延长生存期、提高生活质量的作用,但其临床疗效在不同患者之间存在差异。中药作为多成分多靶点的治疗方式与现代医学的靶向治疗具有许多相似之处,二者都以具有决定恶性肿瘤特性及预后的指标为作用靶点。酪氨酸激酶在恶性肿瘤的进展中发挥关键和核心作用并成为靶向治疗的主要靶点,也是靶向治疗优势人群的筛选靶点。清胰化积方(Qingyihuaji Formula, QYHJ)为课题组总结多年临床实践的经验方,前期研究发现具有延长胰腺癌患者生存期的作用,是独立的预后相关因素,其临床疗效也表现出一定的差异性,筛选QYHJ方治疗的优势人群具有重要意义。 第一部分：EphB2在胰腺癌生物学特性中的功能定位及机理 目的：采用慢病毒介导的siRNA技术沉默人胰腺癌CFPAC-1细胞中EphB2的表达,观察不同EphB2表达状态下CFPAC-1细胞生物学特性的变化,明确EphB2在胰腺癌中的作用。 方法：慢病毒介导的siRNA技术沉默人胰腺癌CFPAC-1细胞中EphB2的表达。CCK-8检测细胞体外增殖,裸鼠皮下移植瘤模型观察肿瘤生长变化。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化。RT-PCR和Western blot分别检测相关基因mRNA和蛋白表达变化。 结果：研究成功合成并挑选抑制EphB2表达的siRNA序列,稳定转染的CFPAC-1细胞中EphB2 mRNA和蛋白表达显著降低(p0.01,p0.01),建立了EphB2相对低表达的细胞系,命名为CFPAC-1 EphB2 RNAi细胞。EphB2低表达促进了CFPAC-1裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤生长(p0.05)和体外增殖(p0.01)。细胞周期分析显示EphB2低表达后CFPAC-1细胞中S期比例由干扰前的18.15%升至27.18%(p0.05),同时G0/G1期细胞比例由72.93%降至57.61%(p0.05)。此外,EphB2 RNAi后细胞凋亡也明显减少,CFPAC-1 EphB2 RNAi细胞和CFPAC-1 Con RNAi细胞凋亡率分别为1.63%和7.44%(p0.01)。与CFPAC-1 Con RNAi相比,EphB2 RNAi上调细胞周期调控相关的CyclinD1, Cyclin-dependent Kinase 6(CDK6)和抗凋亡相关的Bcl-2 mRNA和蛋白表达。 结论：EphB2在人胰腺癌细胞CFPAC-1生物学特性中发挥抑制生长的作用,相对高表达EphB2具有阻滞细胞于Go/G1期抑制细胞增殖并促进细胞凋亡的作用,其部分机理为抑制调控细胞周期相关的CyclinD1、CKD6和抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表达。 第二部分：清胰化积方干预不同EphB2表达水平人胰腺癌CFPAC-1细胞生长研究 目的：观察QYHJ方对不同EphB2表达人胰腺癌CFPAC-1裸鼠皮下移植瘤生长抑制作用差异,明确酪氨酸激酶受体EphB2表达与QYHJ方干预是否有效之间的相关性。 方法：QYHJ方抑瘤差异通过建立不同EphB2表达状态人胰腺癌CFPAC-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型并以QYHJ方干预四周。采用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡变化,进一步分析其抑瘤机理。RT-PCR和Western blot分别检测相关基因mRNA和蛋白表达变化。 结果：QYHJ方干预四周后,对CFPAC-1、CFPAC-1 Con RNAi细胞抑瘤率分别为31.40%和31.33%,对CFPAC-1 EphB2 RNAi田胞的抑瘤率只有18.36%,QYHJ方对EphB2相对高表达的CFPAC-1细胞表现出更明显的抑制肿瘤生长的作用。细胞周期分析显示QYHJ方干预后,CFPAC-1、CFPAC-1 Con RNi田胞Go/G1期比例分别由67.37%、70.77%上升至76.40%、78.47%,S期细胞由24.70%、22.70%降至17.41%、15.17%,干预组与相应生理盐水组之间Go/G1期差异显著,均有统计学意义(p＜0.05, p＜0.05), Con RNAi细胞两组S期差异也有统计学意义(p0.05),而干预前后CFPAC-1 EphB2 RNAi细胞周期并未发生明显变化。干预后CFPAC-1和CFPAC-1 Con RNAi凋亡细胞比例明显增加,分别由干预前的6.21%和4.97%增加至28.03%和20.98%,但统计分析却未显示有统计学意义,干预后CFPAC-1 EphB2 RNAi田胞凋亡并未发生明显变化,凋亡率分别为11.20%和12.53%,提示其对EphB2低表达的细胞凋亡无调控作用。进一步的机理探索发现QYHJ方干预后EphB2 mRNA和蛋白表达并未发生明显变化,但其配体EphrinB1 (Eph receptor-interacting B1, EphrinB1)的表达却明显升高,干预后CDK6在CFPAC-1和Con RNAi细胞中明显下调,但在CFPAC-1 EphB2 RNAi细胞并未变化。 结论：QYHJ方对EphB2相对高表达的胰腺癌CFPAC-1细胞抑瘤作用较EphB2低表达的细胞明显,其干预优势部分通过阻滞细胞周期于Go/G1期而抑制细胞增殖,与凋亡关系尚不明确。QYHJ方部分通过调控EphrinB1-EphB2-CDK6信号通路而发挥选择性抑制胰腺癌生长的作用。EphB2表达状态可能是QYHJ方治疗优势人群筛选的候选指标之一。