应用比较蛋白质组学寻找预测非小细胞肺癌患者放射性肺损伤生物标记物的研究

【摘要】：1.联合物理剂量学参数和生物因子预测非小细胞肺癌患者接受根治性放疗后发生放射性肺损伤的风险 目的：本研究旨在探索外周血5种炎性／纤维化相关细胞因子,包括白介素-1β(IL-1β)、白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子a(TNF-α)及转化生长因子β1(TGF-β1),在预测放射性肺损伤发生中的价值,以及这些细胞因子与物理剂量学参数联合预测放射性肺损伤的可行性。 材料与方法：58例接受过根治性三维适形放疗的不可手术非小细胞肺癌患者入组此项研究,所有患者随访时间都超过18个月。在放疗前、放疗第2周、第4周分别留取每例患者外周血用于细胞因子检测。其中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α采用人细胞因子Luminex xMAP血浆检测试剂盒(基于微球技术的三文治免疫组化方法)进行浓度测定,而TGF-β1采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行测定。研究终点是发生2级及以上的放射性肺损伤(以下简称“放射性肺损伤”)。通过Z-score模型及Bonferroni校正法鉴定2组患者外周血中的差异表达蛋白。随后采用岭回归分析(ridge logistic regression)建立预测模型,通过交叉验证产生ROC曲线(receiver operating characteristic curve)评估预测模型的灵敏度和特异性。采用曲线下面积(area under the curve, AUC)值来判断模型预测能力。 结果：58例入组患者中,10例(17.2%)发生放射性肺损伤。研究显示发生放射性肺损伤的患者放疗前外周血IL-8浓度显著低于未发生放射性肺损伤的患者。放疗过程中TGF-β1升高与放射性肺损伤的发生也有相关性,统计学处于临界差异。其他三种细胞因子及任一临床因素和剂量学参数都与放射性肺损伤的发生没有统计学相关性。ROC曲线预测模型显示,联合剂量学参数平均肺受量(MLD)和细胞因子IL-8构建的风险预测模型(AUC值0.74)相比于MLD和IL-8这2种单因素预测模型(AUC值0.54和0.69)在预测放射性肺损伤发生风险上具有更好的准确性。 结论：联合炎性细胞因子和肺平均剂量可能获得一个更为准确的预测模型用于预测放射性肺损伤的发生,但需要在今后的研究中通过大样本人群进行验证。 2.非小细胞肺癌患者放疗前、中、后时段外周血蛋白质组学研究以寻找放射性肺损伤可能的生物标记物 目的：在接受放疗的非小细胞肺癌患者中,应用比较蛋白组学来研究放疗后有无放射性肺损伤(2级及以上)发生的两组患者的外周血蛋白质表达谱差异性,以寻找可能预测放射性肺损伤发生的生物标记物。 材料与方法：58例接受过放疗的非小细胞肺癌患者,其中20例患者在放疗前、放疗第2、第4、第6周及放疗后第1、第3个月都有留取外周血标本。这20例患者中,6例发生放射性肺损伤,其余14例没有发生放射性肺损伤(本研究中专指≥2级的放射性肺损伤)。有无放射性肺损伤的2组患者基本临床资料无显著统计学差异性。应用比较蛋白质组学方法检测了2组患者放疗前中后各个时间点外周血蛋白质谱表达差异。这些比较蛋白质组学方法包括：同位素定量标记(ExacTag标记)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)及液质联用电喷射串联质谱(LC-ESI-MS/MS)。蛋白表达差异性比较通过方差分量模型(Variance components models)及Bonferroni校正法来鉴定。方差分量模型用于把某一蛋白在各个时间点的表达情况整合为一个参数,从而在2组间进行比较。该方法用于在小样本条件下提高统计效力。最后再随机挑取部分样品,通过传统的免疫组化方法VWestern blotting进行蛋白定量方法可靠性的验证。 结果：外周血通过蛋白质组学方法共鉴定出超过100种蛋白质并进行了定量,其中有76种蛋白质在至少2例患者及2个时间点上有表达并被检测到。对这76种蛋白质进行统计分析发现,发生放射性肺损伤的患者外周血中C4b结合蛋白a链(C4b-binding protein alpha chain, C4BPA)、补体C3和玻连蛋白(Vitronectin, VTN)这3种蛋白质的放疗前中后动态表达水平显著高于未发生放射性肺损伤者(P0.01)。以放疗前、放疗第2、第4、第6周及放疗后第1、第3个月为动态时段观察,以上三种蛋白在发生与未发生放射性肺损伤患者中的比值分别为1.60、1.36和1.46(P0.01)。若以放疗前、放疗第2、第4、第6周为动态时段观察,以上三种蛋白在发生与未发生放射性肺损伤患者中的比值分别为1.66、1.34和1.46(P0.01)。Western blotting结果显示,蛋白质组学方法显示高表达的样品在Western blotting里也是高表达,蛋白质组学方法显示低表达的样品Western blotting结果也显示低表达,验证了蛋白质组学定量方法的可靠性。 结论：采用蛋白质组学方法比较非小细胞肺癌患者放疗后发生与未发生发射性肺损伤者外周血蛋白表达谱,能够鉴定出两组患者在放疗前中后这段总时间内外周血中的动态差异表达蛋白,这些差异表达蛋白有可能成为新的预测放射性肺损伤的潜在外周血蛋白标记物。以往文献尚未见采用蛋白质组学方法寻找放射性肺损伤外周血蛋白标记物的报道。 目的：本研究通过比较蛋白质组学方法在非小细胞肺癌患者放疗前(基线水平)的外周血标本中寻找可能用于预测放射性肺损伤新的潜在生物标记物。 材料与方法：58例接受过放疗的非小细胞肺癌患者中,48例随访超过2年的患者进入此项研究,9例患者发生放射性肺损伤,其余39例患者未发生放射性肺损伤。每例患者在放疗开始之前的2周内留取外周血标本(贫血小板血浆)。通过一系列蛋白质组学研究方法,包括同位素定量标记(ExacTag标记)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)及液质联用电喷射串联质谱(LC-ESI-MS/MS),鉴定2组患者放疗前外周血蛋白质谱表达水平。通过Z-score模型及Bonferroni校正法鉴定2组患者外周血中的差异表达蛋白。再通过传统的免疫组化方法VWestern blotting进行蛋白质组学定量方法可靠性的验证。随后采用岭回归分析(ridge logistic regression)建立预测模型,通过交叉验证产生ROC曲线(receiver operating characteristic curve)评估预测模型的灵敏度和特异性。采用曲线下面积(area under the curve, AUC)值来判断模型预测能力。 结果：共鉴定出200多种蛋白质,对其中在超过60%患者外周血标本中表达的蛋白进行统计分析,发现C4b结合蛋白a链(C4b-binding protein alpha chain)及玻连蛋白(Vitronectin, VTN)在发生放射性肺损伤患者的外周血中表达水平显著高于其在未发生放射性肺损伤患者的外周血中表达水平(p值分别为0.001和0.02)。这种表达差异性通过传统的免疫学方法Western Blot检测得到一致的结果。通过IPA (Ingenuity Pathway Analysis)数据库检索发现这两种蛋白都是炎性反应的重要因子,并且与目前已知的放射性肺损伤病理生理通路,如TGF-β1、IL-8及炎性反应相关通路之间有一定的相关性。ROC曲线预测模型显示,VTN单因素、C4BPA+V(?)(?)N、及C4BPA+VTN+MLD这3种预测模型(AUC值均大于0.7)相比于C4BPA和MLD这2种单因素预测模型(AUC值0.4-0.49)在预测放射性肺损伤发生风险上具有更好的准确性。 结论：采用蛋白质组学研究方法比较非小细胞肺癌患者放疗后发生与未发生发射性肺损伤者外周血蛋白表达谱,能够鉴定出两组患者在放疗前(基线水平)外周血中的差异表达蛋白,这些差异表达蛋白有可能成为新的预测放射性肺损伤的潜在外周血蛋白标记物。以往文献尚未见采用蛋白质组学方法研究放疗前放射性肺损伤外周血蛋白标记物的报道。

【关键词】：放射性肺损伤 细胞因子 白介素-8 转化生长因子β1 非小细胞肺癌 放射性肺损伤 蛋白质组学 生物标记物 非小细胞肺癌 蛋白质组学 生物标记物 放射性肺损伤
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R734.2
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