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《复旦大学》 2010年
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清胰化积方对人胰腺癌肝转移的实验研究

尹建华  
【摘要】:胰腺癌(Pancreatic carcinoma)是消化系统常见的恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势。胰腺癌也是预后最差的恶性肿瘤之一,5年生存率不到5%-胰腺癌肝转移是导致胰腺癌总体疗效差的主要原因,80%的患者在确诊时已发生局部浸润或远处转移,肝转移发生率超过50%。对胰腺癌肝转移目前还缺乏特别有效的药物和治疗方法。晚期胰腺癌放化疗效果欠佳,清胰化积方(QYHJ)以清热化湿为组方原则,运用中西医综合治疗模式在晚期胰腺癌患者中取得了一定的疗效。胰腺癌相关转移因子在其癌周组织含量比较丰富,对此进行的研究也是胰腺癌治疗的一个重要方向。 目的 观察清胰化积方(QYHJ)对人胰腺癌肝转移的干预效应;对相关转移因子的表达变化进行检测从而探究QYHJ在胰腺癌肝转移治疗中的可能作用机理。 方法 第一部分 采用人胰腺癌高肝转移细胞株SW1990HM,通过脾脏注射法,建立人胰腺癌SW1990HM肝转移裸鼠动物模型,将实验分为4组:生理盐水组(NS).QYHJ大、中、小三个剂量组(QYHJ-H、QYHJ-M、QYHJ-S)进行干预。以体重变化、小鼠肝转移发生数及肝转移克隆数和肝转移灶体积为观察指标,观察QYHJ干预后对生存质量的影响及对肝转移的抑制作用;评价QYHJ对肝转移的干预作用是否具有剂量递增效应。 第二部分 清胰化积方(QYHJ)干预人胰腺癌肝转移的机制研究,主要从以下方面进行: 1. RT-PCR检测:将各组小鼠肝转移灶部分肿瘤新鲜组织,在液氮中研成细末,Total RNA抽提后,进行RT-PCR半定量检测,观察各组中MMPs、VEGF、cyr61、TGF-β1、bFGF等转移相关因子的rnRNA水平上的表达变化; 2.免疫组化检测:根据RT-PCR的检测结果,对mRNA水平表达有显著差异的相关因子在组织水平进行免疫组化检测,从阳性细胞表达数观察肿瘤组织中相关因子QYHJ干预后的变化及从阳性区域光密度面积判断相关因子在肿瘤细胞中的表达变化。 3.探究各因子的表达变化与肝转移灶增殖生长之间的相关性,并进一步作回归分析判断与肝转移灶增殖生长有直接相关的转移因子。 4. western blot检测:取各组小鼠肝转移灶部分肿瘤组织,总蛋白提取后进行western blot检测,观察与肝转移灶增殖生长的相关因子表达变化,进一步从分子水平验证免疫组化的分析结果,明确QYHJ抑制胰腺癌肝转移的作用靶点。 5. ELISA对各组血液中的CEA及CA19-9进行检测,观察QYHJ干预后的变化。 6.流式细胞术检测QYHJ干预后各组的细胞周期变化及凋亡变化。 结果 第一部分 1.QYHJ各用药组在第6周观察结束时的裸鼠体重高于生理盐水组(NS)体重(P0.05),其中尤以QYHJ高剂量(QYHJ-H)组更显著(P0.01)。 2.QYHJ大、中、小剂量各组肝转移发生率分别为57.1%(8/14)、42.8%(6/14)、60%(9/15)、NS组为73.3%(11/15);与NS比较,QYHJ大、中、小剂量组的肝转移发生抑制率分别为22.1%、41.6%、18.1%。 3.与NS组相比,QYHJ大、中、小剂量组均显著减少肝转移克隆个数(P0.01);而QYHJ各组之间则无显著差异(P0.05)。 4.与NS组相比,QYHJ各组均可抑制肝转移灶的增殖生长(P0.05),大中小剂量组抑制率分别为45.5%、45.6%、24.6%。QYHJ各组之间比较,大中剂量组的抑制率比小剂量组强(P0.05);大中剂量之间无差异(P0.05)。 第二部分 1.与NS组比较,QYHJ干预后,大、中、小剂量组的肝转移灶肿瘤组织中bFGF的mRNA表达分别升高21.8%、47.1%、39.2%(P0.05),QYHJ大、中小剂量组之间无明显差异(P0.05);CTGF mRNA表达在大剂量组中下调9.61%、中、小剂量组分别升高11.5%、9.63%(VS NS, P0.05); MMP-1的mRNA表达分别升高28.3%、12.2%、19.6%,(VS NS, P0.05); MMP-7的mRNA表达上调,分别为18.2%、12.9%、1.3%(VS NS, P0.05)。MMP-9的mRNA表达变化分别下调7.4%、13.8%、11.2%(VSNS, P0.05)。 2.与NS组比较,QYHJ干预后,大、中、小剂量组的肝转移灶肿瘤组织中cyr61的mRNA表达下调(P0.05),分别为57.9%、69.5%、29.5%;MMP-2的mRNA表达下调(VS NS,P0.05),分别为42.1%、28.1%、62.3%;TGF-β1的mRNA表达下调(VS NS,P0.05),分别为78.6%、69.9%、33.1%;VEGF的mRNA表达下调(VS NS,P0.05),分别为78.9%、64.9%、43.8%。 3.各组肝转移灶肿瘤组织可见细胞浆染色成棕褐色,细胞基质间也可见棕褐染色。 4.NS组、QYHJ大、中、小剂量组cyr61阳性细胞表达分别为39±1021±3、23±4、32±6,QYHJ各组的cyr61阳性细胞表达下降(VS NS,P0.05):MMP-2阳性细胞表达分别为38±11、28±5、24±4、29±3,QYHJ各组的MMP-2阳性细胞表达下降(VS NS,P0.05);bFGF阳性细胞表达分别为45±8、65±5、64±9、56±6,QYHJ各组的bFGF阳性细胞表达增多(VS NS,P0.05);TGF-β1阳性细胞表达分别为47±10、31±4、29±3、36±6,QYHJ各组的TGF-β1阳性细胞表达下降(VS NS,P0.05);VEGF阳性细胞表达分别为42±7、32±4、29±5、32±5,QYHJ各组的VEGF阳性细胞表达下降(P0.05)。 5.NS组、QYHJ大、中、小剂量组cyr61阳性区域光密度分别为508.82±6.69、319.92±2.96、323.46±4.12、435.29±4.83;VEGF阳性区域光密度分别为447.6±7.54、337.3±5.44、317.8±5.28、360.6±5.42;TGF-β1阳性区域光密度分别为748.66±10.12、435.23±4.77、418.17±5.26、658.41±6.33;bFGF阳性区域光密度分别为661.24±8.13、685.74±5.32、721.56±5.38、771.41±6.24;MMP-2阳性区域光密度分别为538.42±6.47、312.84±4.47、445.75±5.73、239.43±4.32: 6.相关性分析表明cyr61、MMP-2.VEGF、TGF-β1、bFGF的阳性表达与肝转移灶增殖生长的相关性均为正相关,分别为0.677、0.355、0.540、0.402、0.657 7.回归分析结果提示,VEGF、bFGF、cvr61与转移灶体积增殖有依存关系,回归方程:y^=-0.954+0.026χ1+0.023χ2+0.027χ3 8.western blot检测,从蛋白质分子水平进一步验证了mRNA水平和组织学水平的结果。QYHJ各组的VEGF、TGF-β1、cyr61、MMP-2表达均明显低于NS组(P0.05),而bFGF的表达比NS组高(P0.05)。 9.ELISA检测发现QYHJ-H、QYHJ-M、QYHJ-S各组的血液标本中的CEA浓度均值分别为12.51±2.53ng/ml、13.67±2.72ng/ml、15.83±3.16ng/ml,QYHJ组明显低于NS组的23.26±4.62ng/ml(P0.05);NS、QYHJ-H、QYHJ-M、QYHJ-S各组肝转移小鼠的血清CA19-9平均值分别是423.72±45.43 U/ml、318.26±42.13 U/ml、355.47±44.29 U/ml、362.37±45.08 U/ml,QYHJ组明显低于NS组(P0.05)。 10.流式细胞术(FCM)结果:NS组胰腺癌肝转移灶增殖指数为30.72%,QYHJ大、中、小剂量各组的细胞增殖指数分别为19.28%、21.14%及24.63%均小于生理盐水组(P0.05)。细胞周期各时相比较发现,各中药组的G0/G,期细胞均显著高于NS对照组(P0.05),而QYHJ各组的G2/M期细胞比例低于生理盐水对照组(P0.05)。QYHJ大、中、小各组的凋亡率比NS组要高,分别为15.29%、15.42%、11.89%,NS组凋亡率为7.47%,有显著性差异(P0.05)。 结论 第一部分 1.QYHJ能够减少肝转移克隆灶的形成,未见剂量递增效应。 2.QYHJ抑制肝转移克隆灶的增殖生长,大、中剂量优于小剂量,大剂量与中剂量之间无明显差异。 3.QYHJ可以改善实验动物的生存质量,大剂量优于中、小剂量,中剂量和小剂量之间无差异。 4.QYHJ对人胰腺癌SW1990HM肝转移具有一定的抑制作用。 第二部分 1.QYHJ干预后可下调VEGF、MMP-2、cyr61、TGF-β1的mRNA表达水平;下调肿瘤组织中癌细胞对cyr61、VEGF、MMP-2、TGF-β1的蛋白水平表达;抑制癌组织中cyr61、VEGF、MMP-2、TGF-β1(?)日性细胞的产生 2.QYHJ干预后在下调VEGF、cyr61、TGF-β1、MMP-2等相关转移因子的同时,上调转移相关因子bFGF的mRNA和蛋白表达水平,表明QYHJ对胰腺癌肝转移的抑制作用是一个复杂的综合效应。 3.QYHJ干预胰腺癌肝转移灶生长起最终作用的靶点可能为VEGF、bFGF、cyr61。 4.QYHJ能够下调胰腺癌细胞株SW1990HM分泌VEGF、cyr61、TGF-p、,MMP-2等相关因子表达,从而抑制胰腺癌肝转移灶的增殖。 5.QYHJ干预后,能够减少血液中CA19-9和CEA的含量,表明QYHJ对胰腺癌肝转移起一定的抑制作用。 6.QYHJ能促进胰腺癌肝转移灶肿瘤细胞的凋亡,一定程度上诱导细胞周期阻滞,从而达到抑制肿瘤细胞的生长和增殖。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285

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6 何敏;结肠癌肝转移的临床相关危险因素分析[D];南昌大学医学院;2013年
7 王洪敏;结直肠癌肝转移的临床因素分析[D];吉林大学;2010年
8 含笑;肝转移癌TACE疗效评价及影响因素分析[D];安徽医科大学;2013年
9 朱巍莹;小鼠结肠癌肝转移模型的建立及其活化肝星状细胞表达的研究[D];复旦大学;2010年
10 郭勇;晚期胃癌患者血清CEA、CA199水平与肝转移的关系[D];郑州大学;2012年
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