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唐氏综合征无创性产前诊断及相关基因功能的研究

杜颖颖  
【摘要】:第一部分DSCR4用于唐氏综合征无创性产前诊断及其基因功能的初步研究 唐氏综合征是最常见的先天性疾病,大多数患者有轻至中度的智力障碍,迄今尚无有效的治疗方法。减少唐氏综合征危害的根本办法是采取积极的一级和二级预防措施,避免患儿出生。 目前唐氏综合征的常规诊断方法主要是在孕中期血清学筛查的基础上,对高危孕妇通过羊膜腔穿刺或绒毛膜取样获取细胞体外培养后进行核型分析。这些方法周期长、创伤大,胎儿丢失率约为1%,10%左右的高危孕妇为此拒绝接受这些侵入性检查。所以,寻找并建立早期、快速、准确和无创性唐氏综合征诊断方法,是亟待解决的关键临床问题,也是产前诊断的重要目标之一。 无创性产前诊断是指通过采取孕妇的外周血,获得胎儿细胞或游离的胎儿核酸从而诊断胎儿的遗传疾病。其中,孕妇外周血中游离的胎儿DNA含量相对丰富,是胎儿细胞的970倍,占孕妇总DNA的3.4%—2%,且比胎儿mRNA稳定,采血24小时后含量几乎无变化,更适用于无创性产前诊断,但所面临的关键问题是如何在孕妇外周血中区分出游离的胎儿DNA和母体DNA。 研究显示,孕妇外周血中母体DNA主要来源于造血细胞,而游离的胎儿DNA主要来源于胎盘滋养细胞。两者的组织来源不同,造成某些DNA片段的甲基化水平存在相当大的差异,这种差异可以作为区分母胎DNA的生物学标志。有研究报道,位于染色体18q21.3上的SERPINB5基因启动子在孕妇白细胞中呈现高度甲基化而在胎盘组织中却很少甲基化,可认为非甲基化的SERPINB5 (U-SERPINB5)基因来源于胎儿。 为了寻找位于21号染色体上、在母胎之间存在甲基化差异的DNA片段,我们选取了21号染色体上6个基因——CGI137,LRRC3, POTE, COL6A1, AIRE和DSCR4。这些基因的mRNA都是胎盘特异性或高表达的,由此推测它们的启动子区域在胎盘组织中是低甲基化,而在母亲外周血白细胞中是高甲基化的。 通过联合甲基化敏感性限制性内切酶酶切和甲基化结合结构域法,我们比较所选取的6个基因启动子区域的DNA片段在早孕期和晚孕期的孕妇外周血白细胞DNA和胎盘组织DNA之间的甲基化差异,发现AIRE、POTE和DSCR4基因片段在早孕期的母胎之间有甲基化差异。 通过亚硫酸氢盐处理后PCR克隆测序,我们检测了所选基因片段内每个CG位点的甲基化状态,发现DSCR4基因片段的12个CG位点在母胎之间的甲基化差异最为显著——在早孕期胎盘组织中呈低甲基化状态,而在相应的孕妇外周血白细胞中则呈高度甲基化状态。 为了排除克隆测序时的抽样误差,我们通过亚硫酸氢盐联合限制性内切酶分析法,证实所有亚硫酸氢盐处理后DSCR4 PCR产物中两个位于酶切位点内的CG位点确实存在如上所述的母胎甲基化差异。 根据亚硫酸氢盐测序的结果,我们设计了DSCR4甲基化特异性PCR的引物,通过甲基化特异性PCR,我们证实非甲基化的DSCR4 (U-DSCR4)只存在于胎盘组织中,针对U-DSCR4的引物扩增效果好,无引物二聚体,可用荧光染料法(SYBR Green I)进行定量检测。相对定量分析显示,U-DSCR4只存在于早孕期孕妇外周血血浆,而不存在于白细胞中,是位于21号染色体上的胎儿表观遗传学标志。 DSCR4 (Down syndrome critical region gene 4)是唐氏综合征关键区域内的基因之一。DSCR4的mRNA只存在于胎盘组织和两种人绒癌细胞系(JEG3、BeWo)中。唐氏综合征胎儿由于染色体异常,所有的器官包括胎盘同样可能受到影响,特别是对合体滋养层的影响更大,导致胎盘产物生成异常,滋养层功能下降,多个唐氏血清学筛查标志(PAPP-A、hCG等)即基于此原理。胎盘特异性表达的DSCR4基凶在唐氏胎盘滋养层异常的发生中的功能因而成为我们的研究对象。 甲基化特异性PCR证实DSCR4启动子区域在JEG3和BeWo细胞中低甲基化,而在HEK293细胞中高甲基化,提示该基因的甲基化可能和基因表达有关。为了研究DSCR4基因功能,我们原核表达了DSCR4全长蛋白质,作为抗原免疫家兔制备DSCR4的抗血清并通过蛋白A/G beads进行亲和纯化。免疫印迹(Western blot, WB)证实纯化后的抗血清特异性显著改善。通过构建绿色荧光蛋白DSCR4融合蛋白瞬时转染BeWo细胞,检测外源性DSCR4的亚细胞定位以及用自制的抗体直接检测BeWo细胞内源性DSCR4的细胞分布,并通过分别抽提BeWo和JEG3细胞的细胞核和细胞浆蛋白,用抗体进行WB都证实DSCR4定位在滋养细胞核内。随后,我们合成3个针对DSCR4 mRNA的小干扰片段(siRNA), RT-PCR和WB证实2号小干扰片段对DSCR4的转录和翻译有明显的干扰效果。下调DSCR4可以抑制细胞的迁移和侵袭,但不影响细胞增殖。 第二部分唐氏综合征相关微小RNA——microRNA-125b相关功能的研究 微小RNA (microRNA, miRNA)是生物体内长约17—25个核苷酸的非编码小RNA。在细胞核内,编码miRNA的基因最初转录生成pri-miRNA,经过剪切生成60—100个碱基大小、具有发夹结构的单链RNA前体(pre-miRNA),然后被转入细胞质,在Dicer酶加工下形成miRNA成熟体,成熟体miRNA通过与靶mRNA间的互补配对,导致靶mRNA的降解或翻译抑制,从而实现对靶基因的负调控。 唐氏综合征患者伴发白血病的比例较高,所以研究唐氏综合征相关miRNA在肿瘤中的作用也成为我们关注的对象,又因为乳腺癌是本实验室的主要研究方向之一,我们选择了乳腺癌为模型来研究唐氏综合征相关miRNA在肿瘤中的作用。通过总RNA加尾后RT-PCR (poly A RT-PCR)分析了五个唐氏综合征相关miRNA在乳腺癌细胞中的表达,我们发现mir-125b在高侵袭性乳腺癌细胞中高表达,这提示它可能参与乳腺癌细胞的侵袭和转移。 在mir-125b高表达的乳腺癌细胞中,下调mir-125b可以抑制细胞的侵袭转移和增殖能力;相反,在低表达mir-125b的乳腺癌细胞中,上调mir-125b会增强细胞的侵袭转移和增殖能力。我们通过裸鼠成瘤实验进一步确认下调mir-125b可导致肺转移灶数目的减少。在寻找mir-125b的靶基因过程中,我们通过多种方法证明mir-125b可作用于一系列的抑癌基因,它们包括BDP1、P53、BAP1、BAK1和ST18,这也进一步证明了mir-125b的癌基因活性,同时也发现mir-125b主要作用于BDP1的转录水平,对BAK1的转录水平稍有影响,而对P53、BAP1的转录水平影响不大。临床样本分析也显示,与良性乳腺纤维腺瘤和乳腺导管内增生相比,恶性乳腺癌组织中mir-125b的表达量明显增高。这些结果证实mir-125b在乳腺癌中发挥癌基因的活性。


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