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《复旦大学》 2010年
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耐辐射关键蛋白DrRRA及变形链球菌smu.595蛋白的结构和功能研究

刘颖  
【摘要】:本论文主要包括两方面的内容:来自耐辐射球菌DNA修复相关的关键蛋白DrRRA的结构和功能的研究以及来自变形链球菌的smu.595的结构研究。 耐辐射球菌(D. radiodurans R1)具有卓越的耐辐射,抗氧化,抗干燥的能力,即使受到大剂量的电离辐射,它仍能高效修复DNA,重建染色体。在我们所研究的D. radiodurans R1一组DNA修复蛋白中,DrRRA具有双组分系统(two component system,TCS)成员---反应调控蛋白的结构功能特征,和多种DNA修复基因的表达调控相关。TCS的发现和研究已近20余年。它主要存在于真菌,古菌中。整合到信号转导通路中的TCS,通过刺激-反应偶联机制,使生物体可感知外界环境的变化,并做出相应的反应。原核生物中典型的TCS由两个组分构成:组氨酸蛋白激酶(HK, histidine protein kinase)和反应调控蛋白(RR, response regulator protein)。HK感知胞外刺激自磷酸化后,将一个磷酰基转移到RR上,接着RR再引发下游通路的特异反应。我们对DrRRA的研究主要取得了以下成果:大量表达了正确的DrRRA片段,以及单独碳端结构域截断体。纯化并得到DrRRA(1-222)全长蛋白,碳端(123-333)截断体天然蛋白的晶体,以及DrRRA(1-215)截断体硒代蛋白的晶体。得到DrRRA(1-215)硒代蛋白的晶体结构,以及碳端截断体天然蛋白的晶体结构。通过分析和比较DrRRA蛋白的晶体结构,结合氨基酸序列同源性比较,确定DrRRA符合双组分系统的RR的结构特征。通过EMSA实验,从生化的角度证实DrRRA的构象和功能的关系。并发现和初步验证DrRRA所结合的特征DNA序列:CTCC(A/T rich)6-ioC/GCTC。根据蛋白质结构和生化实验的结果,提出了DrRRA作为转录因子可能的调控机制:DrRRA在溶液中存在紧凑和松散两种结构状态,紧凑构型是被抑制的状态,无法结合DNA,只有当两个结构域间的构象改变,使碳端结构域结合DNA的空间足够,才能结合到信号通路下游基因的启动子区,调节转录。这两种状态的分子在溶液中共存,所谓活化是指平衡向活性分子的方向移动。同时我们通过同步辐射小角散射实验,得到DrRRA在体外溶液状态下的紧凑构型,为这一机制提供了又一佐证。 smu.595是北京大学变形链球菌结构基因组计划的一个候选研究对象,功能预测为二氢乳清酸脱氢酶(DHOD)。本课题中,我们报导了smu.595的晶体结构解析。将smu.595克隆、表达、纯化,并经过还原性赖氨酸甲基化法蛋白修饰,获得了高分辨率的smu.595的晶体结构,通过结构分析确定smu.595符合典型的family 1A型DHOD家族成员的结构特征。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q51

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