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《复旦大学》 2011年
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鞘磷脂酶在柯萨奇病毒B3感染心肌细胞中的作用研究

王兴冈  
【摘要】:病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是心血管系统常见病,多发病。虽然大多数预后良好,但约25%-30%的心肌炎患者仍可演变为扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM),威胁生命健康,所以深入探讨其发病机制将为其临床治疗措施的改进与发展提供理论支持,意义深远。 病毒持续感染诱发免疫炎症反应,导致心肌细胞凋亡坏死被认为是VMC发病的基本机制。其主要形态学特征是心肌细胞肿胀,细胞膜破裂和溶解,细胞内炎症因子等因此得以释放,引起严重的炎症反应,因此细胞膜是抵制病毒侵袭的首要屏障。鞘磷脂(Sphingomyelin, SM)是构成心肌细胞膜的重要骨架,在还原性辅酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和脂肪酰转移酶作用下,脂酰CoA和丝氨酸在内质网上生成神经酰胺(Ceramide, Cer),Cer接受由磷脂酰胆碱提供的磷酸胆碱生成SM。同时,SM又可经鞘磷脂酶(sphingomyelinases, SMases)的催化作用,水解为磷酸胆碱和Cer。SMases可以分为三大类:酸性鞘磷脂酶(Acid Sphingomyelinase, ASMase),中性鞘磷脂酶(Neutral Sphingomyelinases, NSMases)与碱性鞘磷脂酶,已有文献报道ASMase与NSMases (Mg2+依赖性与非依赖性两种,即NSMase-1与NSMase-2)在心血管系统中表达较高。由此可见:在SMases的调节下,SM合成和催化降解的平衡是维持心肌细胞完整性的重要条件。 在病毒性心肌炎的发病中,病毒侵袭,细胞膜的损伤是否与SMases表达异常有关?相关途径是否加速病毒的入胞作用?是否因此启动细胞的凋亡过程?目前尚未有相关报道。另外在迄今发现的多种可诱发VMC的病毒中,以柯萨奇病毒B3 (Coxsackievirus B3, CVB3)感染最为常见,因此本实验拟通过观察CVB3感染心肌细胞后SMases(主要是ASMase与NSMases)的mRNA表达水平以及活性的变化等,就SMases在病毒性心肌炎中的作用进行初步探索。 第一部分CVB3感染心肌细胞对SMases表达的影响 目的检测CVB3感染心肌细胞不同时间点,心肌细胞ASMase与NSMases的mRNA表达水平以及活性的变化趋势。 方法原代分离、纯化、培养SD乳鼠心肌细胞,待细胞附壁牢固、搏动强而均匀、活性状态佳时,CVB3感染心肌细胞,同时设立正常对照组。干预Oh、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h几个不同时间点时,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测心肌细胞ASMase与NSMases的mRNA表达量变化;干预4h、12h时,薄层色谱法检测ASMase与NSMases活性的变化。 结果CVB3感染心肌细胞48h内,ASMase与NSMase-2的:mRNA表达水平均高于正常对照组,可能由于复制原料的竞争性,两者的表达趋势存在波动性。ASMase与NSMase-2活性在病毒感染4h,12h时也均高于正常水平。NSMase-1的mRNA表达在感染后各时间点无明显变化。 结论CVB3感染心肌细胞后,ASMase和NSMase-2在病毒入胞以及心肌细胞的损伤过程中可能发挥重要作用,而NSMase-1在此过程中作用不显著。 第二部分SMases表达与病毒复制、心肌细胞凋亡的关系 目的观察CVB3感染心肌细胞不同时间时,SMases表达量、活性增加是否与病毒复制以及心肌细胞凋亡有关。 方法心肌细胞培养、病毒感染方法同第一部分,在干预0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h检测SMases表达变化的同时,Real-time PCR检测心肌细胞内CVB3 RNA的表达水平,TCID50检测细胞病毒滴度,annexin V-FITC荧光标记后流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。绘制SMases表达量、病毒复制与毒性、心肌细胞凋亡率随时间变化的趋势并对比,研究三者之间的关系。 结果CVB3对心肌细胞的侵袭作用体现在CVB3的数量(CVB3 RNA表达)和毒性(滴度)两方面,整体作用强弱与SMases表达一致。CVB3的数量在感染后4h开始并持续增加;病毒的毒性感染后迅速增强,虽然存在波动性但一直高于正常水平。心肌细胞在CVB3感染早期2h、4h时以凋亡为主,感染后期24h时以坏死为主。 结论CVB3感染心肌细胞后早期(8h内),心肌细胞通过自身凋亡等途径抵制病毒入侵,所以CVB3的数量(CVB3 RNA表达)和毒性(滴度)都受到抑制;但最终(8h后)细胞自身保护机制失调,病毒大量复制,毒性增强导致心肌细胞坏死。SMases表达的升降体现了病毒对细胞的损伤程度,当病毒损伤作用(数量和毒力)增强时表达升高,反之亦然。CVB3感染心肌细胞可能诱导SMases表达,损伤包膜,有利于病毒入胞,并介导了细胞的凋亡。 第三部分CVB3感染心肌细胞诱导SMases表达的机制研究 目的观察ERK蛋白在CVB3感染心肌细胞后不同时间的变化以及与SMases的mRNA的关系,初步探讨SMases的mRNA的表达是否是经过ERK激活通路实现的。 方法心肌细胞的培养、病毒感染方法同第一部分,干预0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h不同时间段检测SMases表达变化的同时,抽提细胞蛋白后western blot检测ERK表达变化,所得结果做趋势图、然后与SMases的mRNA变化趋势比较。 结果ERK1、ERK2在CVB3感染后蛋白表达量变化不大,说明病毒感染48h内并未促进ERK的合成;然而ERK激活蛋白(p-ERK1、p-ERK2)变化趋势与ASMase的mRNA变化曲线一致,而且ASMase的mRNA变化滞后约2h,推测ERK蛋白激活通路可能诱导并调控ASMase的mRNA表达;p-ERK1、p-ERK2变化趋势与NSMases的mRNA变化关系不大。 结论CVB3感染心肌细胞后可能使ERK蛋白活化调控ASMase的基因表达,从而促进心肌细胞膜的损伤,易化病毒入胞,增加病毒的感染性。 总结 通过本课题研究发现:CVB3感染心肌细胞后使ERK蛋白通路激活并调控SMases的基因表达。SMases表达增加、活性增强使构成心肌细胞膜骨架的重要成分的SM降解,细胞膜受损促进病毒入胞复制及子代的合成和释放。伴随这一过程,心肌细胞变性、溶解或坏死,产生病毒性心肌炎非特异性炎症。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R542.21

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【参考文献】
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