收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

蛋白质的快速酶解与高效富集新方法研究

姚国平  
【摘要】:随着人类基因组计划的逐步完成,基因组研究的重心从结构基因组学转向了功能基因组学,生命科学随之开始了新的篇章——后基因组时代,蛋白质组学(Proteomics)研究作为后基因组时代生命科学研究的核心内容之一也向研究工作者提出了许多新的挑战。其中,蛋白质酶解是蛋白质进行生物质谱鉴定前的必须步骤。而低丰度蛋白/肽段的分离鉴定对解决生物体生理学、病理学以及药理学方面的重要科学问题有着重大的意义。另一方面,功能化磁性纳米材料作为一种新型的功能材料在生物医学和生物工程相关领域研究领域都显示出了强大的生命力。相对于普通材料而言,功能化磁性纳米材料具有极大的比表面积,极高的表面活性,以及特殊的磁响应性,探索其功能化、智能化,进而将其应用于细胞分离、靶向给药、固定化酶、以及蛋白/肽段选择性分离富集等方面具有重要的现实意义。 本论文针对上述蛋白质组学研究中面临的蛋白质酶解以及特异性蛋白分离富集等方面的热点问题,以功能化磁性纳米材料为基础,开展了一系列研究工作,发展了一些关于蛋白质快速酶解和低丰度蛋白选择性富集的新技术新方法。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下: 第一章概述了蛋白质组学研究的意义、策略和方法,集中讨论了蛋白质快速酶解技术和方法,概述了功能化材料及其在生物分析中的应用。并就生物质谱在蛋白质组学研究技术中的应用展开了一些讨论,最后提出了本论文选题的目的和意义。 第二章探讨了一种简易、快速的蛋白酶解技术,以纳米尺度的磁性碳球为载体,固定胰蛋白酶在其表面,并结合微波加速酶解过程。首先,我们用单步合成法得到强磁性的Fe3O4纳米磁球,接着将其加入到葡萄糖溶液中,通过水热反应得到多聚糖包被的磁性小球。我们以3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)做桥把胰蛋白酶固定在碳球表面。所得到的固定酶磁性碳球被应用于微波辅助蛋白质酶解技术。以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin),肌红蛋白(myoglobin)和细胞色素C(cytochrome c)三种蛋白作标准蛋白测试其酶解效率,结合MALDI-TOF-MS做快速有效的鉴定,分别得到的43%,90%和77%的肽段覆盖率。此外,在酶解结束后,我们能够借助材料本身的磁性方便地把它们同样品溶液分离,以实现重复利用。经测定重复使用5次后,该固定酶仍具有良好的催化效率。最后,我们以人体脑垂体提取物为实际样品对本材料固定化酶作了进一步鉴定。通过数据库检索,共鉴定出其中的485种蛋白(p0.01)。这些结果反映出,这种磁性碳纳米球在未来大规模自动化蛋白测定中有着应用价值。 第三章发展了更为简便的方法,创新性地采用808nm近红外激光技术于水溶液酶解及胶上酶解,并结合MALDI-TOF MS对蛋白进行分析鉴定。与第二章的固定酶技术不同,激光辅助酶解能够很方便地控制酶解进程,且酶解结束后不需要进行样品与固定酶的分离步骤,既简化了酶解过程,又避免了对质谱离子源光栅的污染。同样地,我们以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin),肌红蛋白(myoglobin)和细胞色素C(cytochrome c)三种蛋白作标准蛋白测试其溶液酶解效率,结合MALDI-TOF-MS做快速有效的鉴定,分别得到的42%,89%和76%的肽段覆盖率。此外,我们以标准蛋白BSA和人体血清样品进一步验证了激光辅助胶上酶解的效率,也分别得到了38%和26%的肽段覆盖率。最后为了证实本方法在复杂生物样品检测中的实际应用性,我们对鼠脑提取物进行激光辅助酶解,鉴定得到蛋白酶解后的肽段785个,与之匹配的蛋白134个。未来蛋白质组学的研究目标之一是实现对大量复杂体系中蛋白的自动化分析,本章中发展的激光辅助蛋白酶解方法有望在这种探索过程中得到应用。 第四章基于第二章中通过水热法合成的磁性碳球,利用碳球表面的羟基与高氟硅氧烷反应修饰上高氟化官能团(n-C8F17),并将其运用于氟固相萃取。我们选取含半胱氨酸的Cys-Kemptide作为标准肽段,通过半胱氨酸上的巯基与N-[(3-全氟辛基)丙基]碘代乙酰胺(FIAM)反应特异性地修饰上高氟基团(n-C8F17)。含有高氟基团(n-C6F13,n-C8F17等)的化合物与含氟介质之间存在氟-氟相互作用,经过条件优化,Fe3O4@C@F磁球成功地在将带有氟标记的标准肽段从溶液体系萃取出来。在此基础上,我们还将这种材料应用于较为复杂的体系,如标准肽段与非氟标记衍生的肌红蛋白(myoglobin)的酶解产物混合物,Fe3O4@C@F磁球显示了良好的选择性。这种Fe3O4@C@F磁球合成方法简单,成本低廉,使用灵活方便,对于氟标记物特异性好,因其比表面积大,粒径合适,也可将其装填成亲和色谱柱进行氟标记肽段或蛋白的在线分离富集。 总之,本论文围绕蛋白质组学研究的新技术新方法,发展了多种功能化磁性材料并建立了多种有效的分析方法,为解决蛋白质组学分析中的蛋白质快速酶解、低丰度肽段的分离富集及鉴定问题提供了新颖有效的研究手段和方法。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 沈良,江国华;磁性纳米功能材料研究进展[J];杭州师范学院学报(自然科学版);2001年05期
2 华杰;刘梅;徐仕翀;张玉梅;尹基哲;李海波;;溶胶—凝胶法制备MeFe_2O_4/SiO_2(Me=Co,Ni,Zn)纳米复合材料[J];吉林师范大学学报(自然科学版);2007年04期
3 李季;徐仕翀;刘梅;李海波;;FeCo/Al_2O_3纳米复合材料的制备及表征[J];吉林师范大学学报(自然科学版);2007年04期
4 李志慧;付乌有;许静;杨海滨;刘冰冰;;单分散性Fe_3O_4纳米颗粒的制备及其表征[J];人工晶体学报;2008年04期
5 孔祥生;;录音[J];科学大众(中学版);1953年08期
6 王锡绂;关于原子(离子)的磁性问题[J];大学物理;1984年07期
7 陈德昌,陈俊仪;浙江宁波地区第四纪磁性地层的初步研究[J];海洋地质与第四纪地质;1988年04期
8 潘明宝;;大王山岩体南缘糜棱岩带磁性组构[J];东华理工学院学报(自然科学版);1993年01期
9 张秀成,何华辉;微波磁性孤子的研究[J];磁性材料及器件;1995年01期
10 俞维军;姚国春;夏敏;;《磁铁的磁性》案例评析[J];科学课;2007年04期
11 闫玉丽;赵文杰;杨致;葛桂贤;雷雪玲;王清林;罗有华;;稀磁半导体(Ga_(1-x)Fe_x)As的电子结构,磁性及其稳定性的第一性原理研究[J];原子与分子物理学报;2007年04期
12 林秋宝;李爱玉;文玉华;朱梓忠;;简单金属Al原子链的磁性[J];物理学报;2009年11期
13 李钰梅;邢光建;王怡;武光明;;沉积温度对Zn_(0.95)Co_(0.05)O稀磁半导体薄膜结构与磁性的影响[J];人工晶体学报;2010年02期
14 张蕾;邢怀中;黄燕;张会媛;王基庆;;Si掺杂对缺陷诱导的GaN磁性的影响[J];红外与毫米波学报;2011年03期
15 Doon Gibbs ,D. E. Moncton ,杨锡震;磁性X射线散射[J];大学物理;1986年11期
16 杨应昌,孔麟书,程本培;新型金属间化合物Sm(TiFe)_(12)的结构与磁性[J];物理学报;1988年09期
17 沈保根,杨林原,曹蕾,袁俭,郭慧群;热处理对非晶态R_2Fe_(23)B_3(R=Y,Pr)合金的相结构和磁性的影响[J];科学通报;1992年15期
18 杨燮龙,J.Jing,U.Gonser;穆斯堡尔对纳米固体结构与磁性的研究[J];原子核物理评论;1992年02期
19 刘中夏;师文生;;Li—Zn—Cu系铁氧体磁性和铁磁共振的研究[J];陕西师范大学学报(自然科学版);1993年03期
20 金光熙,丁力,李梅;电子──声子相互作用对AndersonS-d混合模型的影响[J];吉林化工学院学报;1994年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 耿殿禹;张志东;司平占;张维山;赵新国;刘伟;苏会和;胡魁义;金志雄;;具有核—壳型结构的α铁固溶体纳米粒子的制备与磁性[A];纳微粉体制备与应用进展——2002年纳微粉体制备与技术应用研讨会论文集[C];2002年
2 方庆清;汪金芝;焦永芳;李锐;;Co含量对Zn_(0.6)Co_xFe_(2.4-x)O_4结构与磁性的影响[A];第五届中国功能材料及其应用学术会议论文集Ⅰ[C];2004年
3 丁寅;倪科贤;蒋锡群;;磁性壳聚糖-三氧化二铁复合纳米微球的制备及表征[A];中国化学会第27届学术年会第13分会场摘要集[C];2010年
4 贺淑莉;刘丽丽;彭印;姜宏伟;李养贤;;快速退火后FePt薄膜结构和磁性的研究[A];2006年全国功能材料学术年会专辑[C];2006年
5 李丹;林超;吕中伟;;多模态磁性-荧光可降解纳米探针的研制及成像研究[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
6 袁国军;任小明;;一维双-(马来二氰基二硫烯)镍单阴离子分子磁体组装、结构和磁性[A];中国化学会第28届学术年会第8分会场摘要集[C];2012年
7 林英志;;应变时效处理铁铝锰碳合金的相变態与超顺磁微结构之研究[A];海峡两岸第二届工程材料研讨会论文集[C];2004年
8 张凤荣;侯万国;;机械化学法合成磁性类水滑石[A];中国化学会第28届学术年会第12分会场摘要集[C];2012年
9 王朱良;李小丽;许小红;;磁控溅射制备具有室温磁性的Co掺杂ZnO稀磁半导体薄膜[A];第十六届全国半导体物理学术会议论文摘要集[C];2007年
10 牛文国;刘丽峰;郑鹉;姜宏伟;刘翠袖;王艾玲;乔金菊;;Co纳米颗粒的形貌和磁性[A];2008全国功能材料科技与产业高层论坛论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 丁国斌;多功能磁性纳米药物载体的构建及其抗肿瘤效应研究[D];吉林大学;2012年
2 曹杨;磁性补强三元乙丙橡胶复合材料的制备与性能研究[D];中北大学;2012年
3 林慧敏;带鱼下脚料酶解小肽亚铁螯合物结构鉴定及其生物活性研究[D];福建农林大学;2012年
4 赵光辉;磁性可再生载体的制备及其固定化糖化酶研究[D];兰州大学;2011年
5 王光辉;铁基核/壳结构磁性纳米球的合成及应用[D];大连理工大学;2012年
6 王冠男;磁性荧光复合纳米粒子的合成及生物应用[D];吉林大学;2011年
7 毕研平;基于旋转磁场的粒子分离系统[D];天津大学;2011年
8 吕言云;基于超顺磁性纳米粒子的药物载体和基因载体制备及其性能研究[D];吉林大学;2013年
9 周立;超支化聚缩水甘油基无机纳米复合材料的制备及应用研究[D];湖南大学;2010年
10 楚学影;锌基半导体微纳材料的制备、复合、物性及在生物检测中的应用[D];东北师范大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 姚国平;蛋白质的快速酶解与高效富集新方法研究[D];复旦大学;2011年
2 姚磊;基于磁靶向治疗的纳米磁性材料标记技术研究[D];南京理工大学;2010年
3 李彤;CoPt-C纳米颗粒膜的结构、磁性和内部相互作用的研究以及CoPt_3合金膜的结构和磁性的研究[D];首都师范大学;2002年
4 陈权启;溶剂热法制备纳米磁性四氧化三锰的研究[D];中南大学;2003年
5 汪汝武;RMn_6Ge_6稀土锰基化合物的结构、磁性和磁电阻效应[D];武汉科技大学;2004年
6 常铮;磁性纳米固体酸催化剂的制备及催化性能研究[D];北京化工大学;2001年
7 梅长松;磁性纳米固体超强酸的合成及催化性能研究[D];哈尔滨工程大学;2002年
8 商菊清;磁性药物载体交联淀粉空白球制备和生物降解性能研究[D];中南大学;2004年
9 仲崇娜;阴离子柱撑磁性二元水滑石的制备与表征[D];哈尔滨工程大学;2007年
10 钟娇懿;磁性荧光双功能纳米材料的合成及其生物学应用[D];四川农业大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 阳光;肿瘤早期诊断造影剂研究获进展[N];中国医药报;2006年
2 记者 万曦亮;“磁性上饶”成为外商创业乐园[N];上饶日报;2006年
3 记者 白毅;中科院长春应化所磁性纳米药物制备研究获创新成果[N];中国医药报;2009年
4 记者  董映璧;德意科学家破解二氧化镎奇异磁性之谜[N];科技日报;2007年
5 张中桥;磁性支架能防再狭窄吗?[N];健康报;2008年
6 林成功;我科学家制备生物相容磁性纳米晶体[N];中国化工报;2006年
7 陈丹;科学家利用原子空位使石墨产生磁性[N];科技日报;2010年
8 郑铁峰通讯员 王帆;一把钥匙能开遍一幢楼房门[N];中国消费者报;2007年
9 小新;磁性导航立体定向技术有望治疗心律不齐[N];医药经济报;2005年
10 张华;统一润滑油力推新一代双效磁性产品[N];中国工业报;2007年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978