蛋白质的快速酶解与高效富集新方法研究

【摘要】：随着人类基因组计划的逐步完成,基因组研究的重心从结构基因组学转向了功能基因组学,生命科学随之开始了新的篇章——后基因组时代,蛋白质组学(Proteomics)研究作为后基因组时代生命科学研究的核心内容之一也向研究工作者提出了许多新的挑战。其中,蛋白质酶解是蛋白质进行生物质谱鉴定前的必须步骤。而低丰度蛋白/肽段的分离鉴定对解决生物体生理学、病理学以及药理学方面的重要科学问题有着重大的意义。另一方面,功能化磁性纳米材料作为一种新型的功能材料在生物医学和生物工程相关领域研究领域都显示出了强大的生命力。相对于普通材料而言,功能化磁性纳米材料具有极大的比表面积,极高的表面活性,以及特殊的磁响应性,探索其功能化、智能化,进而将其应用于细胞分离、靶向给药、固定化酶、以及蛋白／肽段选择性分离富集等方面具有重要的现实意义。 本论文针对上述蛋白质组学研究中面临的蛋白质酶解以及特异性蛋白分离富集等方面的热点问题,以功能化磁性纳米材料为基础,开展了一系列研究工作,发展了一些关于蛋白质快速酶解和低丰度蛋白选择性富集的新技术新方法。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下： 第一章概述了蛋白质组学研究的意义、策略和方法,集中讨论了蛋白质快速酶解技术和方法,概述了功能化材料及其在生物分析中的应用。并就生物质谱在蛋白质组学研究技术中的应用展开了一些讨论,最后提出了本论文选题的目的和意义。 第二章探讨了一种简易、快速的蛋白酶解技术,以纳米尺度的磁性碳球为载体,固定胰蛋白酶在其表面,并结合微波加速酶解过程。首先,我们用单步合成法得到强磁性的Fe3O4纳米磁球,接着将其加入到葡萄糖溶液中,通过水热反应得到多聚糖包被的磁性小球。我们以3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)做桥把胰蛋白酶固定在碳球表面。所得到的固定酶磁性碳球被应用于微波辅助蛋白质酶解技术。以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin),肌红蛋白(myoglobin)和细胞色素C(cytochrome c)三种蛋白作标准蛋白测试其酶解效率,结合MALDI-TOF-MS做快速有效的鉴定,分别得到的43%,90%和77%的肽段覆盖率。此外,在酶解结束后,我们能够借助材料本身的磁性方便地把它们同样品溶液分离,以实现重复利用。经测定重复使用5次后,该固定酶仍具有良好的催化效率。最后,我们以人体脑垂体提取物为实际样品对本材料固定化酶作了进一步鉴定。通过数据库检索,共鉴定出其中的485种蛋白(p0.01)。这些结果反映出,这种磁性碳纳米球在未来大规模自动化蛋白测定中有着应用价值。 第三章发展了更为简便的方法,创新性地采用808nm近红外激光技术于水溶液酶解及胶上酶解,并结合MALDI-TOF MS对蛋白进行分析鉴定。与第二章的固定酶技术不同,激光辅助酶解能够很方便地控制酶解进程,且酶解结束后不需要进行样品与固定酶的分离步骤,既简化了酶解过程,又避免了对质谱离子源光栅的污染。同样地,我们以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin),肌红蛋白(myoglobin)和细胞色素C(cytochrome c)三种蛋白作标准蛋白测试其溶液酶解效率,结合MALDI-TOF-MS做快速有效的鉴定,分别得到的42%,89%和76%的肽段覆盖率。此外,我们以标准蛋白BSA和人体血清样品进一步验证了激光辅助胶上酶解的效率,也分别得到了38%和26%的肽段覆盖率。最后为了证实本方法在复杂生物样品检测中的实际应用性,我们对鼠脑提取物进行激光辅助酶解,鉴定得到蛋白酶解后的肽段785个,与之匹配的蛋白134个。未来蛋白质组学的研究目标之一是实现对大量复杂体系中蛋白的自动化分析,本章中发展的激光辅助蛋白酶解方法有望在这种探索过程中得到应用。 第四章基于第二章中通过水热法合成的磁性碳球,利用碳球表面的羟基与高氟硅氧烷反应修饰上高氟化官能团(n-C8F17),并将其运用于氟固相萃取。我们选取含半胱氨酸的Cys-Kemptide作为标准肽段,通过半胱氨酸上的巯基与N-[(3-全氟辛基)丙基]碘代乙酰胺(FIAM)反应特异性地修饰上高氟基团(n-C8F17)。含有高氟基团(n-C6F13,n-C8F17等)的化合物与含氟介质之间存在氟-氟相互作用,经过条件优化,Fe3O4@C@F磁球成功地在将带有氟标记的标准肽段从溶液体系萃取出来。在此基础上,我们还将这种材料应用于较为复杂的体系,如标准肽段与非氟标记衍生的肌红蛋白(myoglobin)的酶解产物混合物,Fe3O4@C@F磁球显示了良好的选择性。这种Fe3O4@C@F磁球合成方法简单,成本低廉,使用灵活方便,对于氟标记物特异性好,因其比表面积大,粒径合适,也可将其装填成亲和色谱柱进行氟标记肽段或蛋白的在线分离富集。 总之,本论文围绕蛋白质组学研究的新技术新方法,发展了多种功能化磁性材料并建立了多种有效的分析方法,为解决蛋白质组学分析中的蛋白质快速酶解、低丰度肽段的分离富集及鉴定问题提供了新颖有效的研究手段和方法。