收藏本站
《复旦大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

动脉粥样硬化血栓形成关键蛋白vWF A2结构域的结构与调控机制的研究

陈华  
【摘要】:冠心病是一种最常见的心脏病,是指冠状动脉粥样硬化使得管腔狭窄或阻塞,导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病,目前发病率日益增高。动脉粥样硬化血栓病变是此类疾病的病理基础,导致病人致死、致残的心血管疾病发病过程,大多数都与动脉血栓形成有关。血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)作为动脉粥样硬化血栓形成过程中的关键蛋白,在不同切应力下可以介导动脉血栓形成,是心肌梗死等发病的始动因子之一;vWF的A结构域是其发挥功能的核心结构,尤其是A2结构域内因含有酶切位点而备受瞩目。本课题则将vWF A2结构域作为研究对象,通过对vWF A2结构域三维结构的研究,首次发现了vWF A2结构域中存在一个金属离子结合位点,并综合运用生物化学、分子生物学和生物物理学等方法证明该位点为钙离子结合位点。进一步借助于分子动力学模拟手段和体外酶切的方法,显示钙离子的结合能够稳定A2结构域,导致A2结构域的解螺旋和酶切位点的暴露需要更强的剪切力,从而保护A2结构域不被血管性血友病因子裂解酶(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif-13, ADAMTS-13)过早酶切,精细调节vWF在血液中剪切压诱导下的酶解。并提出了人体通过血液中钙离子浓度精细调节ADAMTS-13酶解vWF的新机制,从而为vWF A2结构域作为潜在抑制血小板活化的作用靶点、在临床上干预动脉血栓形成提供了实验证据。 vWF A2突变体结构域的表达、纯化、结晶和体外酶切调控 [目的]通过体外对vWF A2突变体结构域进行表达、纯化和结晶,获得vWF A2结构域三维结构内关于酶切位点的构象变化,比较与野生型A2结构域构象差异,最后通过体外酶切实验进一步明确vWF A2结构域作为潜在抑制血小板活化的作用靶点。 [方法]首先借助于常规的分子克隆技术,体外对vWF A2突变体表达载体进行构建;然后将该载体转化至原核表达系统-大肠杆菌菌株中进行表达;运用亲和层析、分子筛、透析等多种手段对表达的蛋白进行纯化;以悬滴气相扩散法对纯化蛋白结晶进行筛选和优化;通过计算机技术对空间结构进行重建;最后借助于免疫印迹技术对vWF A2结构域开展体外酶切实验。 [结果]成功实现体外对vWF A2突变体进行了表达和纯化,并于4℃某个最佳结晶条件下拿到了目的蛋白晶体,并对该晶体进行了详细的解析,意外发现了金属离子的存在,并进一步鉴定出该离子为钙离子,通过分子动力学模拟手段和体外酶切的方法,显示钙离子的结合能够稳定A2结构域,导致A2结构域的解螺旋和酶切位点的暴露需要更强的剪切力,从而保护A2结构域不被血管性血友病因子裂解酶ADAMTS-13过早酶切,精细调节vWF在血液中剪切压诱导下的酶解。 [结论]该项研究首次发现了vWF A2结构域中的一个钙离子结合位点,提出了人体通过血液中钙离子浓度精细调节ADAMTS-13酶解vWF的新机制,为进一步研究vWF多聚化的调控机制以及冠心病血栓形成的诊治提供了新思路。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R543.5

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 刘均洪;邱龙辉;曹红光;张媛媛;曹树煜;李燕妮;;一种新的酶结晶方法[J];化学工程;2006年01期
2 李欣欣;徐晓冬;丹媛媛;张密林;;蛋白质结晶的研究进展[J];生物技术通报;2007年06期
3 李兰芬;南洁;苏晓东;;蛋白质晶体学技术的发展与展望[J];生物物理学报;2007年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 冯炜玮;陈志伟;;蛋白质结晶及其影响因素研究进展[J];安徽农业科学;2010年18期
2 卢昌;吴国华;颜新敏;赵志荀;于少雄;叶奕优;朱海霞;李健;张强;;绵羊痘病毒E3L蛋白N端结构和功能预测[J];中国畜牧兽医;2013年06期
3 孙百虎;尚平;;蛋白质晶体生长方法综述[J];石家庄职业技术学院学报;2010年04期
4 墨玉欣;;结晶技术在发酵工业中的应用新进展[J];天津化工;2013年06期
5 杨光弟;杨忠金;周红锋;黄锑儒;;宫颈粘液羊齿状结晶的分形分析[J];云南民族大学学报(自然科学版);2011年01期
6 杨光弟;周红锋;靳林;;水溶性蛋白盐析的一维结晶[J];中国医学物理学杂志;2011年02期
7 刘璇;岳庆喜;果德安;;蛋白质组学技术及其在中药复杂体系研究中的应用[J];中国天然药物;2009年04期
8 王永先;吴文惠;包斌;宋瑞瑞;孙立春;;纤溶活性化合物GDG对溶菌酶结晶特性的影响[J];中国食品学报;2012年12期
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 刘晶晶;蛋白质结晶过程的模拟优化和实验研究[D];中国海洋大学;2010年
2 赵静;基于干涉技术的晶体生长动力学研究[D];中国科学技术大学;2012年
3 吴方睿;蛇根木中两个重要酶的表达,纯化,结晶,复合物三维结构表征和底物扩展研究[D];浙江大学;2013年
4 王会征;一种与聚羟基脂肪酸酯生物合成相关的新型水合酶结构生物学研究[D];山东农业大学;2013年
5 任丽梅;人淀粉代谢相关α-1,4糖苷酶类与其抑制剂相互作用机制的结构生物学研究[D];南开大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张晓莉;水稻黄单胞菌烯酰-ACP还原酶(FabV)晶体学研究[D];华中农业大学;2010年
2 甄凯旋;家蚕假想基因Bm-P312的克隆表达及其定位研究[D];浙江理工大学;2010年
3 邓妍;Fpr3的原核表达及其单克隆抗体的制备[D];华中师范大学;2011年
4 刘旭;基于结构解析的醛酮还原酶AKR5C3的底物选择性研究[D];华东理工大学;2011年
5 姜萍萍;离子液体诱导溶菌酶结晶及机理研究[D];天津大学;2010年
6 谭圆;人类胸腺核苷酸合成酶结构及其与抑制剂相互作用关系[D];青岛科技大学;2011年
7 王臻;女贞过氧化物酶分离、纯化及酶学性质研究[D];江南大学;2008年
8 刘宇佳;离子液体的固定化及其在蛋白质分离中的应用[D];东北大学 ;2009年
9 卫晓彬;小麦胚乳特异性转录因子基因WPBF的克隆、表达及DNA结合特性研究[D];西北农林科技大学;2012年
10 李鹏;灰树花β-葡聚糖合成酶的提取、纯化及其酶学性质研究[D];河南工业大学;2012年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 周远明,张媛媛,刘均洪;利用苯胺检测过氧化物酶活力的方法[J];青岛科技大学学报(自然科学版);2003年05期
2 毛益斌,张蓓蕾;交联酶晶体的研究及应用[J];中国医药工业杂志;2001年11期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 方福德;结构域[J];中华预防医学杂志;2004年05期
2 王云华;病毒晚期结构域研究进展[J];国外医学.病毒学分册;2004年01期
3 杨福愉,屠亚平,冯昶;人红细胞带3蛋白结构域间的通讯[J];科学通报;1995年19期
4 黄波,冯作化,皇甫永穆;纤维结合素结构域与肿瘤[J];国外医学.肿瘤学分册;1999年01期
5 冯云,黄宁,吴琦,鲍朗,王伯瑶;HMGN2抗菌结构域的研究[J];四川生理科学杂志;2004年04期
6 章辉,陈枢青;大肠杆菌T蛋白的调节结构域的定位分析[J];浙江大学学报(医学版);2005年02期
7 方金瑞,黄维真;定向置换细菌和真菌的结构域,推理设计肽类抗生素[J];国外医药.抗生素分册;1998年01期
8 郑宗明,顾晓波,俞海青,梁凤来,刘如林;非核糖体肽合成酶主要结构域的研究进展[J];中国抗生素杂志;2005年02期
9 张莉,赵晶,杨安钢,王成济;转运结构域的研究进展[J];医学分子生物学杂志;2004年06期
10 吕守芹;毛德斌;龙勉;;P-选择素CR结构域功能的模拟预测[J];医用生物力学;2009年S1期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 宋婀莉;田瑞;马素参;高友鹤;;PDZ结构域低丰度配体的筛选方法[A];中国蛋白质组学第三届学术大会论文摘要[C];2005年
2 单璐;童宇峰;冯银钢;王金凤;;金黄色葡萄球菌核酸酶无脯氨酸突变体的溶液结构及骨架动态特性研究[A];第十三届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2004年
3 于长清;沈楠;周建华;;宿主天然抗逆转录病毒蛋白TRIM5α研究进展[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
4 赵明炜;王恩多;;亮氨酰-tRNA合成酶CP1结构域对于种属间tRNA~(Leu)的识别至关重要[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
5 傅成波;杜延顺;黄秉仁;谢云飞;苑玉和;白氡;崔迎彬;;TRAF6与RanBPM相互作用的研究[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
6 于冰;缪泽鸿;蒋轶;李美红;杨娜;李婷;丁健;;c-Jun的非转录功能:与ODD结构域结合地阻断缺氧诱导因子HIF-1泛素化降解[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年
7 刘慧萍;柴玉波;陈苏民;王志珍;;蛋白质二硫键异构酶结构域的克隆与活性研究[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
8 李刚;邰付菊;骆娟;郑勇;李学宝;;两个新的棉花基因在NaCl胁迫下的表达调控分析[A];基因开启未来:新时代的遗传学与科技进步——湖北省遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2009年
9 贾卫;金伯泉;张新海;杨琨;朱勇;刘雪松;李琦;;CD226(PTA1)分子D1结构域参与NK和CTL的功能[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
10 李祥;张家海;曹赞霞;吴季辉;施蕴渝;;GOPC蛋白PDZ结构域的溶液结构及其与Neuroligin羧基末端的相互作用[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 医学院;颜宁研究组在《自然》发文[N];新清华;2011年
2 吴一福;四军医大首次发现人脑抑癌新基因[N];中国医药报;2005年
3 记者 彭德倩;我科学家发现谷类“大个子”基因[N];解放日报;2006年
4 白毅;我国重大疾病相关基因及蛋白功能转化研究获进展[N];中国医药报;2008年
5 北京德宝群兴科贸有限公司 刘晓凯;营养因素对动物体脂肪沉积的影响及调控机理[N];中国畜牧报;2004年
6 记者 项铮;单抗可能成为靶向性强的肿瘤药物[N];科技日报;2005年
7 胡建和 陈永耀 王自良 谢庆阁;新型猪瘟疫苗的研究和应用前景[N];中国畜牧报;2005年
8 本版编辑;血友病:“玻璃人”疾病[N];中国医药报;2006年
9 庄新茂;新型猪瘟疫苗的研究和应用前景[N];中国畜牧报;2005年
10 ;海南医学院及附属医院硕果累累[N];科技日报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴益民;三个含SCAN结构域的锌指蛋白基因ZNF191、ZNF396和ZNF397研究[D];复旦大学;2002年
2 何华伟;肌酸激酶结构域相互作用与活性中心极性微环境的研究[D];清华大学;2007年
3 徐进新;SNX16和SNX11的结构生物学研究[D];中国科学技术大学;2012年
4 张金秀;Patj/Pals1/Mals2三元复合体形成的结构基础研究[D];南开大学;2012年
5 刘奕彤;Ccd1激活Wnt信号通路的分子机制[D];清华大学;2010年
6 毛大庆;野油菜黄单胞菌感光相关基因功能研究[D];清华大学;2011年
7 吴勃;人源蛋白Vav2和Arap3的结构与功能研究[D];中国科学技术大学;2010年
8 陈文钦;草鱼核苷酸结合寡聚化结构域基因和γ-干扰素相关基因的克隆及其表达[D];华中农业大学;2010年
9 阮建彬;组蛋白甲基化位点结合结构域的结构与功能研究[D];中国科学技术大学;2012年
10 张明香;STAT4、STAT6与CBP相互作用及其关键结构域的检测[D];重庆医科大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 夏思思;海洋放线菌氨基酸腺苷化结构域的克隆、表达和酶活性测定[D];华中师范大学;2012年
2 梁琳;颗粒裂解肽抗菌结构域的重组表达和生物活性分析[D];安徽大学;2011年
3 唐自钟;内切葡聚糖酶基因同源和异源结构域重构研究[D];四川农业大学;2011年
4 刘冰冰;蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究[D];华中农业大学;2013年
5 李丽;Connexin 31与p62相互作用的研究[D];中南大学;2012年
6 冯帆;新基因CCP22功能的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
7 王慧敏;重组人pro-EMAPⅡ蛋白N末端结构域作用机制初步研究[D];安徽大学;2010年
8 薄联锋;CARD结构域对猪BCL 10表达及细胞周期的影响[D];西北农林科技大学;2011年
9 白露;真核原核表达UHRF2各结构域突变体蛋白[D];重庆医科大学;2012年
10 杨廷;L-periaxin蛋白核输出机制的初步分析[D];山西大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026