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《复旦大学》 2010年
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小鼠骨髓间充质干细胞向子宫内膜上皮细胞方向分化的体外研究

张雯碧  
【摘要】:子宫内膜异位症(endometriosis, EM)是妇科常见良性疾病,临床主要表现为痛经、不孕、性交痛等,严重影响着妇女的健康和生活。EM的发病有经血逆流、体腔上皮化生、免疫学说等多种学说,但至今病因不明确。随着干细胞研究的不断深入,越来越多的研究证明子宫内膜内存在干/祖细胞,这些干/祖细胞介导子宫内膜的周期性再生。因此有学者提出了EM的干细胞起源学说,认为异位病灶中的终末细胞不能维持病灶的长期发展,而干/祖细胞的分化增殖可能导致EM的发生。本课题组在前期研究中发现小鼠骨髓来源的干细胞在在位和异位子宫内膜内定植并向腺上皮方向分化,并且证实雌激素在该分化过程中起促进作用。本研究将原代培养的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)和小鼠子宫内膜间质细胞(ESCs)进行共培养,选择性加入外源性因素(雌激素和生长因子),从体外实验证实BMSCs可向子宫内膜上皮细胞方向分化,并对其分化的时间以及雌激素对其分化的影响进行分析。本研究目的旨为EM病因研究的干细胞学说提供理论依据,进而为EM的临床诊疗研究提供新的方向。 目的: 1、探讨小鼠骨髓间充质干细胞体外能否向子宫内膜上皮细胞方向分化。 2、探讨雌激素是否影响该分化过程。 材料与方法: 1、原代培养小鼠骨髓间充质干细胞和子宫内膜间质细胞,分别予流式细胞术和细胞免疫化学方法进行鉴定。 2、将第2代BMSCs分别进行如下四组处理。第1组:BMSCs单独培养,对照培养基2%FCS+DMEM/F12;第2组:BMSCs单独培养,诱导分化培养基2%FCS+DMEM/F12,1×10-7mol/L17β雌二醇,lOng/mlTGF-β, lOng/mlEGF, 1Ong/mlPDGF-BB;第3组:BMSCs与ESCs共培养,对照培养基;第4组:BMSCs与ESCs共培养,诱导分化培养基。用Realtime RT-PCR和免疫荧光化学方法检测培养5天后的BMSCs上皮细胞标记角蛋白7(CK7),角蛋白18(CK18),角蛋白19(CK19),上皮膜抗原(EMA)表达。 3、将第二代BMSCs与ESCs共培养,对照培养基。用Realtime RT-PCR方法检测共培养第1、3、5、7天后的BMSCs的上皮细胞标记(CK7,CK18,CK19,EMA)表达。 4、将第二代BMSCs与ESCs共培养,对照培养基,分别加入不同17β-雌二醇浓度(0,1X 10-9mol/L,1 X 10-8mol/L,1 X 10-7mol/L,1×10-6mol/L),用Realtime RT-PCR方法检测各组BMSCs上皮细胞标记(CK7,CK19),间质细胞标记波形蛋白(Vim),干细胞转录因子(Oct-4)的表达。 结果: 1、流式细胞术检测BMSCs表面标记Sca-1,CD117,CD29和造血干细胞表面标记CD34表达率分别为5.36%,2.41%,2.63%,0.68%。细胞免疫化学方法检测ESCs特异标记波形蛋白表达阳性。 2、Realtime RT-PCR结果提示:CK7的表达在各组中呈依次表达上升,在第4组表达中达到最高。CK18,CK19在第2、3、4组中均比第1组表达升高。EMA在第2、4组的表达比第1、3组表达升高。免疫荧光化学方法结果提示:第1、2组中角蛋白表达阴性,第3组表达弱阳性,第4组表达强阳性。 3、CK7表达量随着共培养时间的增加而上升,存在时间差异,在第5天开始出现显著上升。CK18,CK19,EMA的表达量随着共培养时间增加并无明显变化。 4、CK7和CK19表达量在1×10-8mol/L17β-雌二醇组中最高,CK7表达量在1×10-6mol/L17β-雌二醇组中最低。Vim和Oct-4表达量共培养5天后均下降,但不同17β-雌二醇浓度对其没有差异。 结论: 1、小鼠BMSCs在一定条件下体外可向子宫内膜上皮细胞方向分化。外源性因素(17p-雌二醇、TGF-β、EGF、PDGF-BB)和内源性间质细胞分泌因子的联合作用,其在促进BMSCs向子宫内膜上皮细胞方向分化的过程中作用最显著。 2、上皮细胞标记CK7表达量随着BMSCs与ESCs共培养时间的增加而上升,存在时间差异,在第5天开始出现显著上升。 3、1×10-8mol/L17β-雌二醇最大程度地促进了BMSCs向上皮细胞方向分化,1×10-6mol/L17β-雌二醇抑制了BMSCs向上皮细胞方向的分化。
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