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《复旦大学》 2009年
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metK对那西肽生物合成的影响和链霉菌高效转座系统的构建

张欣城  
【摘要】:第一部分 世界上三分之二的抗生素由链霉菌产生,因而链霉菌在大规模工业生产和化学合成酶方面有特殊作用。链霉菌基因工程的研究近年来是一个活跃的领域。本论文研究着眼于那西肽,这是一种含有多个噻唑环并富含硫元素的非核糖体肽类抗生素,由活跃链霉菌Streptomyces. actuosus产生。本研究在链霉菌育种方法的基础上,主要利用基因工程和培养基组分优化的方法来研究那西肽生物合成的代谢途径以进一步提高那西肽的产量,适于工业生产的需要。 首先,构建含有来源于酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒,通过原生质体转化将其克隆至S.actuosus,构建成基因工程菌Z-SAM,并用高效液相(HPLC)证明了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在该株菌中的含量比出发菌株Z-10提高了9倍,达到9.5μg/ml。 其次,为探索那西肽的生物合成代谢途径,本研究对S. actuosus发酵培养基组分进行了优化,有针对性的提高培养基中的碳源和氮源,采用2%麦芽糖,2%葡萄糖,4%淀粉,4%黄豆粉,0.25%硫酸铵,0.2%硫酸钠,0.04%K2HPO4,0.01% MnSO4,0.05% MgSO4,0.25% NaCl,0.003% FeSO4,0.005% ZnSO4作为发酵培养基,并分别在72,120和168小时时补加2%黄豆粉,0.01%丝氨酸,1.25%麦芽糖,1.25%葡萄糖,0.15%硫酸钠和0.15%硫酸铵。在发酵终止后发现基因工程菌Z-SAM的那西肽产量较出发菌株提高了80%,菌株生产稳定,发酵单位达到1746μg/ml。 最后,本论文发现Z-SAM菌体中半胱氨酸的含量比出发菌株Z-10提高了一倍,根据实验结果和文献报道的SAM逆转硫途径,本研究推测在S.actuosus中存在另一条由SAM主导的逆转硫合成那西肽的途径。即由于S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)的高表达导致SAM大量产生,SAM激活了该合成途径,并在其中起到硫提供者的角色,在通过了一系列代谢后使得菌体内半胱氨酸含量提高。而半胱氨酸是那西肽生物合成的重要前体,所以进而使得那西肽的产量提高。 第二部分 随着天蓝色链霉菌A3(2)的全基因组序列的发表,链霉菌的基础研究已进入后基因组时代,大量新基因和功能未知基因的功能有待鉴定。对这类基因的研究将会为阐明初生代谢和次生代谢的基因调控等生物学问题以及次生代谢药物的合成机制提供更多的实验证据。因此大规模突变体库的构建是功能基因组研究的一个重要内容,而利用转座子进行插入突变构建突变体库则是目前广泛应用的方法之一。 转座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在链霉菌中应用的大多数转座子却普遍存在转座效率低下或操作繁琐等缺点。本研究利用天然存在于诺卡氏菌Nocardia asteroids(mexicana)YP21中的转座子IS204,成功构建了一个链霉菌中的微型转座质粒pDZY101。该质粒带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过简单的接合转移将其从大肠杆菌导入到链霉菌中。实验证明该转座系统克服了链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,操作简便且具有高效、随机、遗传稳定等优点。此外本论文在pDZY101的基础构建了一系列衍生质粒对转座酶的作用机制进行了初步研究,证明了IS204的转座酶在链霉菌中只能识别带有一对紧挨着的反向重复序列的环状片断,并进而推测IS204的转座过程涉及到一个环状中间体。通过对转座突变株的大量测序和Southern杂交实验证实该转座系统随机性非常好,而且具有良好的遗传稳定性。这些特点使得该转座系统在链霉菌中具有良好的应用前景。 另外在pDZY101基础上还构建了一个能和链霉菌噬菌体φC31发生同源重组的质粒pFl2,探索了噬菌体转座载体的构建。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R914

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