丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Stk在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用及其机制研究

【摘要】：目的：阐明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine Protein Kinase, stk)在表皮葡萄球菌生物膜形成过程中的作用。 方法：利用同源重组构建stk突变菌株；将stk基因全长以及各功能域克隆到质粒上,转化入stk突变菌株获得互补菌株；采用生物膜半定量方法检测各菌株生物膜的形成；采用初始粘附实验和免疫斑点杂交方法检测不同表皮葡萄球菌菌株的粘附能力和多糖胞间粘附素(Polysaccharide Intercellular Adhesin, PIA)的合成；利用实时荧光定量PCR (Real-time PCR, RT-PCR)检测生物膜相关基因的转录水平；采用Kinase-GloTM激酶发光检测试剂盒检测体外纯化的蛋白激酶活性。 结果： 为了研究stk在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用,我们构建了stk突变菌株并比较了突变菌株与野生菌株生物膜形成的差异,发现stk突变菌株生物膜形成能力显著下降,同时构建的stk基因全长互补菌株显示生物膜形成能力完全回复,证明stk基因对表皮葡萄球菌生物膜的形成具有重要作用。Stk蛋白结构分析发现它具有两个功能域,即蛋白激酶功能域和PASTA (pencilin binding protein and serine/threonine kinase-associated)重复序列功能域,为研究是哪个功能域在生物膜形成中起作用,我们构建了不同功能域的过表达质粒,分别转入stk突变菌株,检测其生物膜表型,发现具有激酶功能域的互补菌株其生物膜表型回复,而PASTA功能域对生物膜形成没有作用。为了进一步证明激酶活性对生物膜形成的重要性,我们构建了stk激酶功能域不同区域的截短突变和点突变,一方面体外表达纯化不同突变蛋白并检测它们的激酶活性,另一方面检测不同突变互补株的生物膜表型,结果表明激酶活性直接影响生物膜的形成,无激酶活性的互补株不能形成生物膜。 与野生菌株相比,stk突变菌株对高分子材料的粘附能力显著下降,并且细胞间粘附因子PIA的合成量减少,这两个表型变化可能是突变菌株生物膜形成能力下降的原因。为了研究stk影响生物膜形成的分子机制,我们利用RT-PCR检测了目前已知的与生物膜形成相关基因的转录水平,发现stk突变菌株中,与PIA合成密切相关的ica操纵子以及粘附因子atlE的转录水平较野生菌株显著降低,而agr数量阈值感应系统的转录水平显著升高,提示Stk可能通过其激酶活性磷酸化修饰相应的底物蛋白,影响生物膜相关因子的表达。 我们的研究同时显示,stk基因不仅调控细菌生物膜的形成,而且也影响其生理代谢,如影响腺嘌呤的合成和细胞壁的代谢。在营养缺陷的RPMI 1640培养基中,stk突变菌株生长速率较野生菌株显著降低,而在培养基中加入腺嘌呤可以使其生长缺陷得到回复。透射电镜可以观察到突变菌株的细胞壁结构异常；进一步研究发现突变菌株对Triton X-100的敏感性显著降低,分泌自溶素的能力也缺乏,同时突变菌株对作用于细胞壁的抗生素敏感性增强,提示Stk影响表皮葡萄球菌细胞壁的代谢。 结论：表皮葡萄球菌stk基因在生物膜形成过程中起重要作用,Stk蛋白的激酶活性与生物膜的形成相关；stk通过调控生物膜相关基因特别是PIA的表达影响生物膜；stk基因同时也影响表皮葡萄球菌的嘌呤合成和细胞壁的代谢。