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《复旦大学》 2012年
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油菜素甾醇信号组分BKI1的双重功能及其介导的一条新的信号转导通路研究

王海娇  
【摘要】:油菜素甾醇(brassinosteroid, BRs)是一类在植物的生长发育过程中起重要作用的激素,主要调控茎的伸长、维管束的分化、雄性育性、种子大小和萌发、开花时间、衰老进程以及植物对生物和非生物胁迫的抗性等。BR信号转导起始于位于细胞膜的受体BRI1 (brassinosteroid insensitive 1),以前的研究认为BKI1 (BRI1 kinase inhibitor 1)与BRI1互作并抑制BRI1的功能。在没有BR时,BKI1定位在细胞膜与受体BRI1互作,并抑制BRI1的活性,进而抑制了BR信号的输出;当BR信号存在时,BKI1从细胞膜解离到细胞质中,解除对BRI1的抑制,从而BR信号通路被激活。但是BKI1是如何从细胞膜上解离以及解离到细胞质的功能一直是BR信号转导领域的关键问题。本论文主要研究BKI1的解离机制及细胞质中BKI1的功能,揭示BR信号转导通路的生化和分子机制,并得到了以下3个主要结论: 1.揭示了BKI1从细胞膜解离的机制。为了研究BKI1的解离机制,首先通过对过量表达BKI1氮末端和碳末端的转基因植物的表型和BR报告基因的分析及其蛋白的亚细胞定位的观察,发现BKI1的氮末端主要决定BKI1的膜定位;而BKI1的碳末端主要与BKI1从细胞膜的解离和在细胞质的生物学功能有关,并且过表达BKI1的碳末端可以增强BR信号输出。通过磷酸化质谱技术鉴定到多个BKI1被BRI1磷酸化的位点,并发现其中S270和S274的磷酸化对BKI1的解离起关键作用,它们的突变导致BKI1永久的细胞膜定位。过表达双突变体S270/274A或单点突变体,导致植株更加矮小,且对BR信号不敏感。酵母双杂交实验表明S270/274A不影响BKI1和BRI1的互作;体外激酶实验表明S270/274A突变导致BKI1被BRI1磷酸化的底物磷酸化水平降低。 2.阐明了BKI1与14-3-3互作并相互调节的机制。为了进一步研究BKI1解离后在细胞质中的功能,通过LC-MS/MS质谱实验鉴定到了一个与BKI1互作的蛋白14-3-3K。通过体外和体内实验发现14-3-3K和磷酸化后的BKI1互作。对BKI1中14-3-3蛋白的保守结合基序进行分析表明S270和S274所在的基序和报道的14-3-3s的结合基序类似。而且,体内和体外互作实验表明S270和S274突变后的BKI1和14-3-3K不再互作。有意思的是,在BKI1过表达株系中过表达14-3-3K蛋白可以挽救BKI1的表型,但是不能挽救S270/274A的表型。此外,通过在烟草叶片中观察14-3-3K对BKI1定位的影响,发现14-3-3蛋白可以帮助磷酸化BKI1从细胞膜上的解离。 3.发现了BKI1在BR信号通路中的正调控功能。为了研究BKI1的生理功能,我们筛选到一个低表达量的BKI1转基因株系。通过生理实验,我们发现,在BR的浓度较低时,BKI1主要定位在细胞膜作为负调控因子抑制BRI1活性和BR信号;而在高浓度BR下,BKI1作为正调控因子促进了BR信号。此外,通过竞争实验,发现磷酸化的BKI1可以解除14-3-3K对BES1的抑制作用,从而促进BR的信号输出。 以上结果充分表明,在BR信号通路中,BKI1和14-3-3s既起负调控作用,又起正调控作用,并直接连接BR信号通路的细胞膜组分和下游转录因子。对于BKI1来说,当BR浓度低时,BKI1作为一个负调控蛋白抑制BRI1与正调控蛋白的结合,从而抑制了BR信号的传递;当BR浓度高时,BRI1将BKI1的S270和S274位点磷酸化,磷酸化后的BKI1与BES1竞争14-3-3s,从而使更多磷酸化的BES1进入细胞核,促进BR调控基因的表达。对于14-3-3s来说,当BR浓度低时,14-3-3s和磷酸化的BES1/BZR1结合从而使它们滞留在细胞质中,抑制BR信号的传递;当BR浓度高时,14-3-3s和磷酸化的BKI1互作,释放对BES1/BZR1的抑制,使它们有更多机会进入细胞核,启动BR诱导基因的表达。 本论文通过遗传学、细胞生物学、生物化学和植物生理学的方法发现了BR信号的重要组分BKI1从细胞膜到细胞质的解离机制,并发现了BKI1的新功能-解离后在细胞质发挥正调控作用,从而建立了一个全新的由BKI1和14-3-3所连接的短而高效的BR信号转导通路。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q946

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