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《复旦大学》 2012年
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热休克转录因子1通过抑制HMGB1减少H_2O_3诱导的心肌细胞坏死及其机制研究

虞莹  
【摘要】:氧化应激损伤存在于许多病理生理过程中,如炎症、缺血再灌注损伤、脑卒中等。在氧化应激过程中,由于细胞内活性氧族的累积导致细胞与组织的损伤。 高迁移率族蛋白1(high mobility group box1, HMGB1)是一个30KDa的核蛋白,正常情况下主要表达于细胞核内,被活化的免疫细胞和坏死的组织细胞分泌到细胞外。而胞外的HMGB1能与坏死细胞释放出的DNA片断、TNF-α等因子结合,直接造成组织损伤甚至坏死[1],也能通过活化免疫细胞、上调炎症因子的表达,放大炎症作用进一步加重组织损伤。故胞外的HMGB1作为一种“坏死标志物”,对坏死有正相调节作用。 热休克转录因子1(heat shock transcription factor1, HSF1)是一种细胞处于应激状态下被激活的转录因子,其自身与下游的热休克蛋白(heat shock protein,HSP)具有多种生物学功能[2-8],包括抗炎症、改善心肌缺血及病理性心肌肥厚等,而其抑制细胞坏死的保护作用也被广泛研究。有研究[9]显示,热休克反应及HSP72能抑制H202诱导炎症细胞释放HMGB1。但是作为热休克反应活化的主要因子及HSPs上游因子的HSF1在组织细胞(如,心肌细胞)中能否有上述效应仍不清楚。 c-Jun末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族成员,其在许多应激条件下被激活,包括UV、炎症因子等。已有研究证实[10],JNK分子参与H202诱导炎症细胞分泌HMGB1的过程。 本研究拟通过利用HSF1病毒转染心肌细胞后,使用H202干预构建氧化应激模型,观察HSF1在氧化应激条件下能否通过负性调控HMGB1抑制细胞坏死,并探究其可能的机制。 第一部分热休克转录因子1对H202诱导的心肌细胞坏死的保护作用 目的转染空病毒及热休克转录因子(HSF1)病毒后,利用过氧化氢(H2O2)干预离体心肌细胞构建氧化应激模型,观察HSF1对H202诱导的心肌细胞坏死的影响。 方法培养1-2日龄新生SD大鼠心肌细胞,分别转染空腺病毒及热休克转录因子(HSF1)高表达腺病毒后,利用浓度为0.5mmol/L的H202干预心肌细胞6小时及24小时。用试剂盒抽提细胞RNA、RIPA提取细胞总蛋白检测空病毒及HSF1病毒转染心肌细胞效果;运用CCK-8染色线粒体内的脱氢酶,检测HSF1对H2O2诱导的心肌细胞毒性、活力的影响;收集细胞上清检测LDH水平,观察HSF1对H2O2诱导的心肌细胞坏死的影响。 结果与对照组(空病毒)相比,HSF1组HSF1mRNA、蛋白表达均显著升高(P0.05)。CCK-8染色结果显示,H2O2干预后,空病毒组与HSF1组的细胞活力均显著下降(P0.05);H2O2干预24小时后两组细胞的细胞活力均比各自在H202干预6小时后的细胞活力显著降低(P0.05);在相同干预条件下,HSF1组细胞活力显著高于空病毒组(P0.05)。LDH水平检测显示H2O2干预后,空病毒组与HSF1组细胞上清中LDH水平显著升高(P0.05);H2O2,干预24小时后两组细胞上清中LDH水平比各自在H2O2干预6小时后的LDH水平显著升高(P0.05);在相同干预条件下,HSF1组上清LDH水平显著低于空病毒组(P0.05)。 结论本研究成功转染HSF1病毒,使心肌细胞HSF1mRNA和蛋白表达均显著升高。利用H202干预后,空病毒组及HSF1组心肌细胞活力显著下降、上清LDH水平显著升高,均呈现显著的时间依赖性;并在相同干预条件下,HSF1组较空病毒组显著保留了细胞活力、降低上清LDH水平。 第二部分热休克转录因子1对H_2O2诱导的高迁移率族蛋白1改变的影响 目的观察HSFl能否负性调节HMGB1,即HSF1→HMGB1→坏死。 方法培养1-2日龄新生SD大鼠心肌细胞,分别转染空腺病毒及热休克转录因子(HSF1)高表达腺病毒后,利用浓度为0.5mmol/L的H2O2干预心肌细胞。收集细胞上清、RIPA提取细胞总蛋白检测不同部位HMGB1的表达水平;并通过特异HMGB1抗体染色检测心肌细胞内HMGB1的分布。 结果上清HMGB1水平检测结果显示:空病毒组在H202干预3小时、6小时及12小时后上清中HMGB1水平比H2O2干预前显著升高(P0.05),且空病毒组在H202干预12小时及24小时后上清中HMGB1水平比H2O2干预6小时后显著降低(P0.05);HSF1组在H2O2干预3小时、6小时后上清中HMGB1水平比H2O2干预前显著升高(P0.05),且HSF1组在H2O2干预6小时、12小时及24小时后上清中HMGB1水平比H2O2干预3小时后显著降低(P0.05);在相同干预条件下(H202干预6小时、12小时及24小时后),HSF1组上清中HMGB1水平比空病毒组显著降低(P0.05)。检测细胞内HMGB1总蛋白表达,结果显示在H2O2干预6小时后,两组细胞胞内HMGB1表达均显著下降(P0.05),但两组间HMGB1表达未见显著差异。免疫荧光显示,H202干预6小时后空病毒组与HSF1组HMGB1在胞浆中的分布显著增加,并且HSF1组HMGB1胞浆的分布量显著少于空病毒组。 结论HSF1于氧化应激6小时后通过阻止HMGB1从胞核向胞浆内转移、减少HMGB1释放,发挥保护心肌细胞抗氧化应激的作用。 第三部分热休克转录因子1调节高迁移率族蛋白1的信号通路研究 目的探讨可能参与HSF1对HMGB1负性调控的相关信号通路。 方法培养1-2日龄新生SD大鼠心肌细胞,分别转染空腺病毒及热休克转录因子(HSF1)高表达腺病毒后,利用浓度为0.5mmol/L的H2O2干预心肌细胞。利用RIPA提取细胞总蛋白检测HSF1下游热休克蛋白(HSP27、HSP90)的表达、c-Jun末端激酶(JNK)的活化水平。 结果检测HSP27、HSP90表达显示:与H2O2干预前相比,空病毒组与HSF1组在H2O2干预6小时、12小时及24小时后胞内HSP27、HSP90表达均显著升高(P0.05);在相同干预条件下,HSF1组胞内HSP27、HSP90表达比空病毒组显著升高(P0.05)。检测JNK的活化水平显示:H2O2干预10min后,空病毒组与HSF1组细胞p-JNK表达均显著升高(P0.05),且HSF1组p-JNK水平显著低于空病毒组(P0.05)。 结论HSF1可能通过上调其下游的HSP27和HSP90表达、抑制JNK活化负性调控HMGB1。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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【参考文献】
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