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《复旦大学》 2012年
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醛固酮瘤甲基化芯片验证及多巴胺受体2在醛固酮瘤和正常肾上腺甲基化及表达差异的研究

陈晨  
【摘要】:目的原发性醛固酮增多症(Primary aldosteronism, PA)为醛固酮过度分泌而引起低肾素、低血钾和高血压的疾病,是继发性高血压最常见的病因。原醛症中最常见的两个亚型为:醛固酮瘤(Aldosterone-producing adenoma, APA)和特发性醛固酮增多症(Idiopathic hyperaldosteronism, IHA)。其中以醛固酮瘤最多见,约占原醛症的60%-90%,而醛固酮瘤发病机制至今仍不明确。目前我们主要从表观遗传学角度研究醛固酮瘤的发病机制,特别是DNA甲基化对醛固酮瘤发生的影响。前期实验中我们利用甲基化芯片筛查异常甲基化基因并研究其表达与正常肾上腺的差异。现我们对前期结果进行验证。有文献报道,多巴胺受体2(Dopamine receptor2, DRD2)在醛固酮瘤患者中表达降低,并能促进醛固酮分泌,在此我们对APA中多巴胺受体2的表达及甲基化情况进行了研究。方法我们选取5例醛固酮瘤组织和5例正常肾上腺组织,均经临床表现和术后病理证实,提取组织DNA,经亚硫酸盐处理后,采用直接测序甲基化技术(BSP)验证甲基化芯片筛查结果。主要选择芯片结果中甲基化程度高并且Real time-PCR技术证明其表达显著降低的三个基因位点BECN1、ACAT1、MCCC1进行验证。然后收集15例醛固酮瘤组织和3例正常肾上腺皮质组织,进行Real-time PCR技术和甲基化特异性的PCR法(MSP)分析多巴胺受体2(DRD2)的表达和甲基化情况。 结果前期研究中甲基化芯片筛查出的高甲基化基因BECN1、ACAT1、MCCC1表达显著降低,但我们实验中发现三个位点均为去甲基化,与芯片结果不一致。研究多巴胺受体2基因(DRD2)发现DRD2在醛固酮瘤组织中表达确实是下调的,AC(t)值为(12.59±2.45),正常肾上腺组△C(t)值为(9.44±1.96)。病例组是正常对照组的(0.35594±0.15383),差异有统计学意义(P=0.0020.01)。进一步研究甲基化情况,在病例组15例醛固酮瘤组织(APA)中甲基化标本为9例,另6例为去甲基化,病例组甲基化率为60%;3例正常肾上腺为对照组,均为去甲基化,甲基化率为0%。随后对病例组样本分组进行表达研究,甲基化组△C(t)值为(12.27±2.65),是正常肾上腺组织的(0.2754±0.20082),非甲基化组△C(t)值为(11.24±2.44),是正常肾上腺组织的(0.4768±0.32569), RT-PCR结果显示甲基化醛固酮瘤组较去甲基化醛固酮瘤组表达有降低趋势,但没有统计学差异(P=0.5530.01),而甲基化组与正常对照有统计学差异(P=0.0020.01),去甲基化组与正常对照组也有统计学差异(P=0.0050.01)。 结论 1.前期甲基化芯片发现的甲基化程度增加的基因BECN1、ACAT1、MCCC1以直接测序法未能证实其启动子区域高甲基化。 2.多巴胺受体2基因在醛固酮瘤组织中表达减少。 3.多巴胺受体2启动子区域的甲基化部分参与多巴胺受体2的低表达。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R736.6

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