收藏本站
《复旦大学》 2012年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Rho激酶及其异构体在肠炎及肠粘膜屏障功能损伤中的作用及机制

赵媛  
【摘要】:研究背景和目的: 肠粘膜屏障功能损伤伴随着炎症性肠病的整个过程,其解剖基础是紧密连接结构的破坏。Rho激酶(ROCK)可通过调控下游肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化状态对细胞骨架结构造成影响,从而在维持紧密连接结构中发挥着至关重要的作用。NF-κB作为ROCK的另一下游信号分子同时也是调控各种炎症因子分泌的重要转录因子之一,因此ROCK亦有可能通过激活NF-κB促进肠道的炎症反应。本研究目的在于探讨Rho/ROCK在肠道炎症及肠粘膜屏障损伤过程中的作用及相应的作用机制。 研究方法: 60只Balb/c小鼠随机分为3组:正常对照组(n=10)、模型组(n=30)及Y-27632(n=20)组。模型组及Y-27632组小鼠于第1天以TNBS乙醇溶液灌肠;Y-27632组于第1天至第7天分别腹腔注射1Omg/kg的Y-27632qd。对照组则予以相应剂量的生理盐水处理。各组小鼠均于第8天处死。通过观察小鼠一般情况、死亡率及肠道炎症的病理评分评价小鼠肠道炎症情况;透射电镜观察小鼠肠道粘膜的紧密连接形态;以荧光素标记法检测肠道粘膜通透性;免疫组化法及Realtime-PCR法分别测定紧密连接蛋白ZO-1、Occludin以及相应的mRNA表达。通过Western blot法测定ROCK1、ROCK2及其下游因子phospho-MYPT-1Thr696、phospho-MLC Ser19、IκBα、phospho-IκBa Ser32/36、NF-κB p65及NF-κBp65Ser536的表达。 研究结果: 模型组小鼠出现明显肉眼血便,且死亡率明显高于另外两组。Y-27632组小鼠肠壁炎症及肠道通透性较模型组明显改善。各组小鼠透射电镜下肠粘膜紧密连接形态未见明显差异。模型组小鼠肠壁紧密连接蛋白ZO-1及Occludin表达下降,经Y-27632干预后Occludin表达升高而ZO-1无明显变化。Y-27632组ROCK1及ROCK2的表达均受到明显抑制。模型组小鼠肠壁P-MYPT-1Thr696变化不明显,而P-MLC Ser19明显增加,Y-27632组小鼠P-MYPT-1Thr696及P-MLC Ser19表达均明显受到抑制。模型组小鼠肠壁IκBα表达较正常组下降,且P-IκBαSer32/36表达明显减少,下游NF-κB p65表达较正常组增加,P-NF-κBp65Ser536表达明显增加;Y-27632干预组与模型组比较,IκBα表达总量增加且P-IκBαSer32/36表达亦明显增加,而下游NF-κBp65及P-NF-κBp65Ser536表达均受到明显抑制。 结论: 1.通过抑制ROCK可以缓解TNBS诱导的小鼠肠道炎症,并可改善肠粘膜通透性。 2. ROCK通过促进下游MYPT-1及MLC的磷酸化,从而改变肠粘膜紧密连接功能,进而影响肠道粘膜屏障功能。 3. ROCK激活后可促进IκB。的总量表达,并可通过促进IκB。Ser32/36磷酸化从而激活IκBα,其下游NF-κBp65表达总量亦增加,且NF-κBp65的激活与其Ser536的磷酸化相关。 4. ROCK有可能通过激活NF-κB通路从而造成炎症因子的大量分泌,进而促进肠道炎症病变的进展。 研究背景和目的 ROCK在哺乳动物中存在两种异构体——ROCK1及ROCK2。尽管二者在结构上存在高度相似性,仍有研究显示其在功能上存在差异。本研究目的在于筛选出ROCK1、ROCK2的有效干扰片段,分析二者对下游MLC信号通路及NF-κB信号通路影响的差别,从而深入研究ROCK在肠炎过程中的作用机制,找出影响肠粘膜屏障功能的关键ROCK异构体。 研究方法 分别针对ROCK1及ROCK2设计干扰序列,选取慢病毒pGLV-H1-GFP+Puro(LV3)作为载体,将干扰序列克隆至LV3内,产生LV3-shROCK1及LV3-shROCK2,测序鉴定后与辅助包装载体共同转入293T细胞中进行病毒包装后侵染Caco-2细胞。于侵染后72h及96h分别以Realtime-PCR及Western blot法于检测ROCK1、ROCK2表达以验证干扰效率,从而筛选出有效干扰片段。 将细胞分为正常对照组;NC组;TNF-α组;NC+TNF-a组;LV3-shROCKl组;LV3-shROCK2组;LV3-shROCK1-shROCK2组。分别以Realtime PCR及Western blot法检测ROCK1、ROCK2及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的基因及蛋白表达;Western blot法检测NF-κBp65及phospho-NF-KB p65Ser536以了解NF-κB通路,检测phospho-MYPT-1Thr696及phospho-MLC Ser19以了解MLC通路。 结果 根据Realtime-PCR及Western blot结果筛选出ROCK1有效干扰片段ROCK1-homo-1197及ROCK1-homo-1479; ROCK2有效干扰片段ROCK2-homo-797及ROCK2-homo-3051。 TNF-α刺激24h后,TNF-α组及NC+TNF-α表达ROCK1及ROCK2蛋白均较无TNF-a刺激组明显增加。ROCKs被干扰后,ROCK1及ROCK2蛋白均有不同程度下调。LV3-shROCK1及LV3-shROCK2组NF-κBp65表达被抑制程度接近;而当ROCK1及ROCK2被同时干扰时,NF-κBp65表达则受明显抑制。ROCK2被干扰后,phospho-NF-κBp65Ser536表达较其在ROCK1干扰时明显减少。TNF-α刺激可引起phospho-MYPT-1Thr696及phospho-MLCSer19表达增加。ROCK1被干扰后phospho-MYPT-1Thr696表达明显降低,但单纯ROCK2被干扰时其表达降低不明显。ROCKs被干扰后phospho-MLCSer19的表达亦被抑制,但抑制程度与所干扰的ROCK异构体种类无关。各组细胞紧密连接蛋白ZO-1及Occludin的表达无显著差别。 结论 1.紧密连接蛋白的表达量TNF-α刺激及ROCKs的干扰均无相关性。 2. ROCK1及ROCK2对NF-κBp65激活作用类似,但在NF-κBp65Ser536的磷酸化过程中更多依赖于ROCK2的激活作用。 3. ROCK1及ROCK2对MLC Ser19磷酸化作用类似,但MYPT-1Thr696的磷酸化主要受ROCK1调控。说明ROCK2对MLC Ser19可能主要为直接作用或间接通过MYPT-1Thr696之外的其他途径所致。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R574

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王耀峰;马全祥;袁向山;杨杰;吴敏;杨志军;文小军;;八氯代二苯并二噁英致小鼠肝脏病理损伤及Caspase-3的影响[J];毒理学杂志;2011年05期
2 肖树华;;曼氏血吸虫病小鼠用4-异硫氰基-4′-硝基二苯胺(CGP4540)治愈后其肝脏的药物代谢能力的恢复情况[J];国际医学寄生虫病杂志;1979年04期
3 郑葆芬,单易非,陈伟俊,吴正泉,吕妹珍,程立,黄春妹;小鼠L6565白血病病毒的分离及其性质[J];复旦学报(医学版);1980年01期
4 张芳荣;范维珂;;H_(796)腹水癌细胞的染色体核型及带型研究(摘要)[J];四川生理科学杂志;1982年02期
5 王淑芬,时云林,郭保忠,高徐生;不同品系小鼠对约氏疟原虫-斯氏按蚊系统敏感性的观察[J];动物学杂志;1983年03期
6 刘淑华,雷伦君,李志旺;照射小鼠骨髓基质对造血干细胞支持功能的观察[J];中国医学科学院学报;1985年06期
7 王绮如,袁维道;老年小鼠的造血机能[J];中南大学学报(医学版);1986年02期
8 张覃沐,林晨,王绵英;乙双吗啉(AT-1727)对小鼠L_(1210)细胞周期的影响[J];科学通报;1986年10期
9 严玉辰,刘学礼,贾克丽,张方振,刘俊,赵荣辉,刘国敏;肾综合征出血热病毒灭活疫苗的研究——Ⅰ.疫苗病毒株选择的研究(摘要)[J];中国媒介生物学及控制杂志;1986年04期
10 李笠,张谅魁,杨坚,赵曼华,沈明洪;~(125)I标记HBsAg在孕鼠及胎鼠体内分布的实验观察[J];山东大学学报(医学版);1986年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 贾丹兵;李乃民;刘珊;李春杰;张永丰;;参姜锁阳益气片的急性毒性实验研究[A];中国中西医结合学会诊断专业委员会2009’年会论文集[C];2009年
2 张伟;冯娟;陈炜;张小娟;袁树民;廉虹;张连峰;;系统表达HB-EGF转基因小鼠的建立[A];实验动物与药理学、毒理学研究学术交流会论文汇编[C];2009年
3 宋根娣;柴保国;赵卫东;李春丽;郑振宇;;卵子突变基因在小鼠早期胚胎发育过程中作用机理研究[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
4 闵静;;竹节参皂苷抗炎作用的实验性研究[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
5 陈福伟;杨国宇;李宏基;郭豫杰;鲁维飞;;小鼠脂肪组织中孤啡肽及其受体基因表达的研究[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
6 刘向前;吴少庭;秦莉;袁仕善;黄达娜;雷明军;潘晖榕;林绮萍;张仁利;高世同;刘能保;;几种SARS DNA疫苗对Balb/c小鼠重要器官影响的组织病理学研究[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
7 李文丽;梁欣;海春旭;;光气诱导小鼠肺水肿的凋亡相关基因表达[A];2008陕西省环境与健康论坛论文集[C];2008年
8 张玉仙;王文利;陈耀星;王子旭;李然;张凡健;;不同浓度大蒜溶液对小鼠小肠黏膜免疫相关细胞数量变化影响的研究[A];新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会论文集[C];2010年
9 赵刚;倪娅;徐云丹;;一种基于实验新理念的小鼠微核实验方法[A];基因开启未来:新时代的遗传学与科技进步——湖北省遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2009年
10 刘玉龙;周剑影;王国权;戴宏;段莹莹;郭晓葵;李元;;人重组白细胞介素-8(rhIL-8)对受照小鼠抗放作用的实验研究[A];中华医学会放射医学与防护学分会第三次全中国青年学术交流会论文摘要汇编[C];2001年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报实习 生金平 本报记者 张咏晴;“乙肝小鼠”成人类替身[N];文汇报;2005年
2 奇 云;单亲小鼠可能打开潘多拉魔盒[N];大众科技报;2004年
3 记者 刘恕 刘霞;利用皮肤细胞培育出健康小鼠[N];科技日报;2009年
4 何德功;小鼠实验证明小脑严重缺乏亦能存活[N];医药经济报;2005年
5 宿健桃;药用植物多糖类成分药理作用综述[N];中国中医药报;2002年
6 周松;TRPM8是“冷”蛋白[N];中国医药报;2007年
7 甘勃;后基因组时代看小鼠继续“开天”[N];大众科技报;2008年
8 陆家训;P-53蛋白质有两面性[N];健康报;2002年
9 陈军梅;用粉色颠覆IT产品设计规则[N];中国质量报;2008年
10 吴洣麓;小鼠医院:老鼠为我们而病[N];北京科技报;2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘琰;五羟色胺对小鼠社会行为的影响[D];北京协和医学院;2008年
2 马宁;小鼠神经行为测试组合建立及邻苯二甲酸二异丁酯对小鼠学习记忆影响的研究[D];中国疾病预防控制中心;2011年
3 王芳;应激和丰富环境及1-脱氧野尻霉素对小鼠衰老相关行为改变的影响[D];安徽医科大学;2012年
4 张斌;适于微米切片的小鼠全脑标本制备方法研究[D];华中科技大学;2011年
5 许袖;谷胱甘肽过氧化物酶3在小鼠围着床期子宫中的表达、调节与功能[D];东北农业大学;2011年
6 冯秋婷;PDK1在小鼠心血管发育过程中的作用和机制研究[D];南京医科大学;2011年
7 张松林;诱导受体产生一氧化碳减轻小鼠移植心缺血再灌注损伤和排斥反应的机制研究[D];华中科技大学;2010年
8 杨冬;Peroxiredoxin 6对细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的作用及机制研究[D];复旦大学;2009年
9 王志军;寡聚脱氧核苷酸对小鼠急性酒精性肝损伤的影响[D];吉林大学;2012年
10 牛晓琳;β3-肾上腺素能受体调控NOS偶联在压力负荷小鼠心肌肥厚中的作用[D];第四军医大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 熊会海;针灸中药对肿瘤模型小鼠细胞免疫功能影响的实验研究[D];天津中医学院;2003年
2 杨炜曦;新肌纤生成调节因子MR-1基因功能的初步探讨[D];吉林大学;2004年
3 赵学明;双重套式PCR对小鼠桑椹胚OPS法冷冻后性别鉴定[D];中国农业大学;2005年
4 代小华;醋酸棉酚对小鼠精母细胞中染色体配对行为的影响[D];河南大学;2005年
5 井小会;人参皂甙Rg3治疗小鼠恶性腹腔积液的实验研究[D];昆明医学院;2007年
6 廖海艳;一氧化氮对小鼠胚胎植入的影响[D];湖南农业大学;2008年
7 曲玉秀;两种遗传工程小鼠的检测、鉴定与种质保存方法的研究[D];南京农业大学;2003年
8 顾克菊;免疫抑制宿主Toll样受体表达及对烟曲霉菌感染免疫应答[D];第四军医大学;2005年
9 陈永卫;肝癌微波治疗后残留肿瘤生物学特性的变化及对机体的影响[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年
10 刘玉香;二氧化硫对小鼠几种脏器超微结构及细胞因子水平的影响[D];山西大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026