收藏本站
《复旦大学》 2012年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基于微流控芯片的免疫反应快速检测系统研究

张金玲  
【摘要】:本博士学位论文的主要贡献在于:针对生物医学快速检测中所面临的三大缺陷——成本高、分析时间长、检测灵敏度低,开创性的设计制作了以高分子聚合物PDMS芯片为分析平台,通过有效的修饰方法对微流控芯片通道表面进行修饰和改性,成功实现了微流控芯片通道内生物分子的固定,为生物医学中重大问题的快速检测提供了新的方法,实现了对环境藻毒素的高灵敏度检测,为现场应用提供了基础;并且,成功的对疟疾病实现了临床检测,具有快速、灵敏、高效等优点;完成了对肝癌CTC的快速高效检测,为肝癌的个性化治疗提供可靠的指导。 过去的二十年,是微流控技术发展的二十年。从Manz和Widmer等人1990年首次提出微型全分析系统(Miniaturized Total Analysis System, μTAS)的概念,到2002年Quake等以“微流控芯片大规模集成”为题在Science上发表文章,微流控技术作为当前分析科学的重要发展前沿,在研究方面取得了飞速的发展。分析检测技术手段的逐步微型化,以及现场“即时检测”的提出对分析技术提出更高的要求。因此发展针对生物医学中实际重大问题的微流控快速检测系统是微流控芯片研究与应用的重要方面。 首先,环境中有毒物质的快速检测是目前快速检测领域的重点和难点之一。随着有害水藻的爆发,会产生大量的有害藻类毒素。这些毒素通过食物链,进入鱼类、贝类体内,人食用了污染的鱼类、贝类会引发食物中毒,甚至威胁生命健康。国内外现行的藻类毒素检测技术主要包括:生物检测法,化学检测法,细胞毒性检测技术,放射性标定法,以及免疫检测等。其中,生物检测法主要采用喂食小鼠、家蝇等毒素的方法,缺点是周期长,费用高,重复性差,而且需要专门培训的人员来操作。化学检测法,主要通过高效液相色谱,毛细管电泳,色谱质谱联用方法,重现性好,但设备功能单一,体积大和价格昂贵,便携性、选择性差。细胞毒性检测技术,直观方法来观察加入毒素后,细胞的反应来判断毒素种类,灵敏度高,但只能做定性测量,不能测定浓度而且需要良好的细胞培养技术。放射性标定法仪器昂贵,测试费用高,并且适用毒素检测范围窄。免疫检测技术主要利用抗原和抗体专一、特异结合的特点对毒素进行定性,定量检测,现主要有直接竞争检测法,间接法,“三明治”法。这种方法专一性强,灵敏度高,是非常有潜力的一种方法,但操作比较繁琐,商业化试剂盒价格昂贵,主要为手工操作,自动化程度低而且需要专业人员。 其次,针对重大传染病的临床快速诊断是微流控芯片在应用研究的重要方面。近年来,由于疟原虫对药物、传播媒介对杀虫剂抗性的迅速发展,疟疾快速的诊断对控制全球疟疾的作用显得更加重要。迄今为止,显微镜镜检(厚血膜、薄血膜)仍是疟疾诊断的金标准。但是显微镜镜检作为一种诊断方法又存在一些问题,由于疟原虫形体小,形态相似,难以染色和检出,需要有经验的人员才能做到正确的诊断。疟疾流行区由于熟练镜检技术人员及设备缺乏,仅依靠传统厚薄血膜镜检法已越来越不能适应当前疟疾诊断的需要随着免疫学技术的发展,间接荧光抗体和ELISA均很快在疟疾诊断中得到应用,但是此类方法抗体用量相对较大,成本较高。而且,反应时间长,不能满足快速诊断的要求。PCR技术显示了较高的敏感性和特异性可以对疟原虫的感染做出早期快速诊断。但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持,不适合作为疟疾流行区常规的检测手段,难以在基层推广应用。 最后,针对肝癌循环肿瘤细胞的高灵敏度捕获受到现有技术的制约。采用反转录聚合酶链式反检测HCC患者外周血中甲胎蛋白mRNA从而检测HCC患者CTCs的报道较多。然而,RT-PCR法有其固有局限,如易产生假阳性和假阴性、操作难以标准化、不能准确估算样本中CTC的数目等。此外,更不可忽视的是,RT-PCR法须破坏细胞形态,不能对单个CTC进行观察、分析和计数,而这些数据可提供CTCs恶性程度和侵袭性方面的信息。因此迫切需要建立特异和敏感的循环肝癌细胞分离和检测技术。目前分离CTCs的标准方法是基于肿瘤细胞表面上皮性抗原的磁性激活细胞分选技术(magnetic-activated cell separation, MACS)。由于缺乏针对肝癌细胞表面特异性抗原的单克隆抗体,迄今鲜见MACS用于分离循环肝癌细胞的报道。尽管肝癌细胞属于上皮性细胞,但EpCAM仅在约35%左右的HCC组织标本中表达。因此,现有系统并不适合用于高通量、高灵敏度分离与检测循环肝癌细胞。 针对以上快速检测领域所面临的三大问题,本博士学位论文分为五章节开展研究中作。各章节主要内容如下: 第一章是绪论部分。本章主要讨论微流控芯片的发展概况,生物医学分析领域的发展现状和遇到的挑战,以及微流控芯片技术在生物医学分析方面的应用进展。从而引出本论文工作的研究方向,为设计发展微流控芯片在生物医学分析快速检测领域应用的新方法研究提出理论依据和实际意义。 第二章主要介绍集成化微流控免疫芯片系统用于环境藻类毒素的高灵敏度快速检测分析新方法研究。我们研究建立了用于对代表性藻类毒素微囊藻毒素(microcystins, MCs),石房蛤毒索(Saxitoxin, STX)与柱孢藻毒素(cylindrospermopsin, CNY)三种藻类毒素的现场快速检测微流控芯片。可以对实际样品(水样和鱼类、贝类等食物样品)溶液中MC, STX与CNY进行快速检测的微流控芯片。实验建立了用于对代表性藻类毒素微囊藻类毒素的现场快速检测微流控芯片。芯片包含七个可以同时控制,也可独立操作的免疫亲和反应柱,可以对实际样品(水样和鱼类、贝类等食物样品)溶液中微囊藻毒素进行快速检测的微流控芯片。检测限为0.02ng/ml。实现对多个样品快速,平行的检测。 第三章主要介绍基于抗体检测的微流控芯片用于疟疾快速临床检测的新方法研究。我们研究了针对在条件欠发达地区多发的传染性疾病疟疾(Malaria)其临床快速现场诊断,提出可行的方案。建立了基于间接免疫荧光反应原理的快速检测微流控芯片用于疟疾病(Malaria)的临床诊断研究。实验中通过检验病人血清样品中的MSP1-19与PfF2抗体的检测,实现了疟疾临床快速诊断,免疫反应中得到的不同荧光强度,可以被信号采集模块采集分析,从而提供临床诊断信息。在同一块芯片实现双抗原同时检测。实验证明,微流控芯片免疫系统可以得到可靠的检测结果,并且极大的节约了抗体用量,缩短了反应所需时间,使得检测成本极大的降低。结果指示,研究中采用MSP1-19与PfF2双抗原检测的方法,对疟疾进行快速检测可以提供相对更加可靠的诊断结果。结果显示,研究建立的微流控芯片免疫系统与方法可以有效的用于基于抗体的疟疾血清学检测,为条件欠发达地区的疾病现场检测,实现疾病有效控制提供可行方案。 第四章主要介绍肝癌循环肿瘤细胞(CTC)的微流控芯片分离检测系统新方法研究。我们在实验中建立了一种具有高度特异性和敏感性的肝癌循环肿瘤细胞分离与检测系统。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者体内的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs),即循环肝癌细胞,是HCC转移和复发的根源。检测循环肝癌细胞对于预测HCC转移复发无疑具有重要临床意义。研究中建立了一种独特的基于ASGPR及其配体相互作用的循环肝癌细胞微流控芯片分选方法,结合基于肝细胞特异性抗体Hep Par1的免疫荧光染色鉴定,发展了一种新的循环肝癌细胞分离与检测系统。实验中用标准细胞加入全血,测定了系统工作的最佳条件。实验证明系统具有很好的特异性和敏感性,且操作方便,易于标准化。分离到的CTCs可进行免疫形态学鉴定和计数。并初步显示了该系统用于临床检测的可行性。 第五章主要介绍高密度结构PDMS芯片制作技术研究。我们讨论了对微流控芯片的制作软光刻技术提出改进,从而得到稳定重复的微结构。为具有高密度阵列微结构的PDMS芯片制作,提供可靠的方法。针对聚合物材料PDMS芯片在复制模塑成型过程中出现的缺陷问题进行了研究,设计了含有50μm高的不同密度微柱阵列芯片。运用实验提出的方案,成功实现了其复制成型,并且保证了模板的多次重复利用。其最低密度共含有14,400个微柱(40mm×18mm),最高密度含有39,760个微柱(40mm×18mm),其对应的最大结构密度为5×104/cm2。本研究为简化复杂PDMS芯片制作处理,提出一步涂层/一步灌注的方法,实现简易操作提供了依据。该研究得出了PDMS芯片制作的具体工艺条件,并进行优化,获得了完整的加工技术方案。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R446.6

手机知网App
【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 葛丹;NSCs三维培养及其微流控动态模型的构建[D];大连理工大学;2013年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 朱睿,肖松山,范世福;微流控芯片检测技术进展[J];纳米技术与精密工程;2005年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨军;刘琳琳;陈默;郑小林;宫兆涛;;用于软光刻的恒温实验台的设计[J];传感器与微系统;2010年06期
2 崔宁;于海霞;;基于微流控生物PCR芯片的荧光PCR分析研究[J];电子测量技术;2010年05期
3 霍丹群;刘振;侯长军;杨军;罗小刚;法焕宝;董家乐;张玉婵;张国平;李俊杰;;微流控芯片光学检测技术在细胞研究中的应用与进展[J];分析化学;2010年09期
4 毛丽华;刘军贤;陈萍;梁建平;王桂文;姚辉璐;;拉曼光镊流式细胞仪的构建及其在地中海贫血分析中的应用[J];分析化学;2010年11期
5 刘莹;宋满仓;王敏杰;张传赞;刘军山;刘冲;;微结构塑件注射成型试验研究与缺陷分析[J];高分子材料科学与工程;2010年05期
6 陶琳;罗怡;张彦国;张宗波;王晓东;;超声波键合能量引导微结构PMMA基片的制作(英文)[J];光学精密工程;2009年06期
7 楚纯朋;蒋炳炎;周陆腾;聂胜钊;;聚合物微流控芯片的注射成型[J];高分子材料科学与工程;2013年06期
8 徐明波;;微全分析系统的检测技术及其发展动态[J];湖北师范学院学报(自然科学版);2007年02期
9 罗怡;张彦国;张宗波;;Hot embossing of micro energy director for micro polymer fusion ultrasonic bonding[J];Journal of Harbin Institute of Technology;2011年06期
10 宋满仓;刘莹;祝铁丽;张传赞;刘军山;刘冲;;微流控芯片注塑成型缺陷的成因与对策[J];机械工程学报;2011年06期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郝振霞;高聚物微流控芯片上金属微器件的研制和应用[D];浙江大学;2010年
2 席永清;离心式微流控法快速分析环境污染物的研究[D];东华大学;2011年
3 王慧香;基于微流控芯片的免疫传感器和蛋白质组学研究[D];复旦大学;2011年
4 杨灿;注塑微结构复制性能及形态研究[D];华南理工大学;2011年
5 董家乐;基于可视阵列传感对细胞代谢过程的研究[D];重庆大学;2011年
6 张黎川;微流控芯片平台的构建及其在肺癌细胞化疗耐药研究中的应用[D];大连医科大学;2011年
7 文伟力;聚合物微流控芯片的制作、检测及仿真研究[D];吉林大学;2007年
8 张恒;基于三维组织培养的肺腺癌血清标志物的筛选和鉴定[D];中南大学;2009年
9 倪晓芳;细胞图型及微流控芯片上的细胞培养和分化[D];华东师范大学;2010年
10 李元城;微流控芯片上胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对兔关节软骨细胞体外增殖的影响[D];大连医科大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄瑞香;基于拉曼光谱技术的抗血管生成药物对血管与组织损伤的研究[D];福建师范大学;2010年
2 王秋平;基于微流控技术的感染性病原体基因诊断研究[D];广州医学院;2011年
3 肖雅静;基于图像处理的微流控芯片检测方法与技术研究[D];河北工业大学;2011年
4 杨辉娟;PDMS芯片电泳分离检测废水中酚类环境激素[D];苏州大学;2011年
5 许龙芳;聚合物微流控芯片压印成型模具关键技术研究[D];中国科学院研究生院(长春光学精密机械与物理研究所);2010年
6 程昊;零电位电化学检测技术[D];广西大学;2006年
7 陈其锋;不可逆双安培法的研究及其在药物分析中的应用[D];广西大学;2007年
8 朱为维;电泳芯片非接触电导检测器的研究[D];重庆大学;2007年
9 古冬冬;基于微全分析系统PCR基因芯片的光谱检测技术研究[D];北京工业大学;2008年
10 王慧香;基于微流控芯片的免疫传感器研究[D];复旦大学;2008年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王树森,胡蕴玉,罗卓荆,刘慧玲,梁伟,章庆俊,阎明,姚庆君;硫酸肝素复合胶原蛋白制备新型神经组织工程支架材料[J];第四军医大学学报;2004年10期
2 向云;燕铁斌;;脑梗死后内源性神经干细胞激活机制研究进展[J];神经损伤与功能重建;2009年05期
3 林小敏;关水;葛丹;刘天庆;马学虎;崔占峰;;壳聚糖-明胶-透明质酸-硫酸肝素复合支架的制备及性能评价[J];高校化学工程学报;2012年02期
4 杨志明,余希杰,黄富国,解慧琪;外源性Ⅰ型胶原对人胚骨膜成骨细胞生物学特性的影响[J];华西医科大学学报;2001年01期
5 齐志国;朱晓峰;;不同细胞外基质对神经干细胞分化影响的实验研究[J];黑龙江医药科学;2007年03期
6 周亚浩;李雷;叶大田;;用于细胞成像的便携型微流控芯片检测系统[J];清华大学学报(自然科学版);2009年09期
7 赵红斌;马敬;杨银书;刘旭东;董菊子;马慧;;胶原神经导管对外周神经缺损修复的实验研究[J];生物医学工程与临床;2010年02期
8 顾其胜,严凯;胶原蛋白在组织工程及临床中的应用[J];上海生物医学工程;1999年03期
9 陈静涛,徐政,顾其胜;胶原蛋白研发的最新进展[J];上海生物医学工程;2004年02期
10 杨晓运,李智,秦绿叶,于常海;星形胶质细胞和神经元之间谷氨酸-谷氨酰胺的代谢偶联[J];生理科学进展;2003年04期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 杨振华;微环境对牙周再生及相关间充质干细胞分化影响的研究[D];第四军医大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 徐新宇;组织工程应用的胶原蛋白制备与改性研究[D];天津医科大学;2005年
2 刘洋;机械应力对表皮干细胞增殖、分化影响的研究[D];第三军医大学;2006年
3 李玲巧;细胞培养芯片的研制及芯片内骨髓间充质干细胞分化控制的前期研究[D];厦门大学;2009年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;快速检测出甲型H1N1流感病毒的试剂盒研制成功[J];湖南畜牧兽医;2009年03期
2 王丽;徐振波;赵喜红;钟青萍;;环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157[J];食品与发酵工业;2011年05期
3 严子林;;快速检测人血清狂犬病抗体的免疫粘连血凝试验[J];国际生物制品学杂志;1984年05期
4 ;一种快速检测巨细胞病毒免疫荧光法[J];华中科技大学学报(医学版);1987年04期
5 李凯年;用膜滤器免疫荧光染色快速检测脑脊髓液中的细菌[J];国际检验医学杂志;1991年04期
6 谢健屏;常汝虚;刘琪;谢集明;;应用APAAP桥联酶标法快速检测呼吸道合胞病毒[J];广州医药;1991年06期
7 任怡敏;白岚;梁玉;许屏;孟刚;;应用吖啶橙染色快速检测沙眼衣原体[J];中华医学检验杂志;1996年02期
8 王千秋;以高危人群标本比较两种沙眼衣原体快速检测试验[J];国外医学.皮肤性病学分册;1998年06期
9 于晓伟,张春玲,姜平;气泡试验在淋球菌快速检测中的应用[J];江西医学检验;1998年04期
10 孔朝霞;;在急诊室检测HIV可早期发现患者[J];国外医学情报;1999年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王益梅;;PDMS-2在儿童运动发育障碍评估中的研究进展[A];全国儿科护理学术交流会议论文汇编[C];2011年
2 杨铁宁;李永川;徐庚;徐龙;宋健;刘庆国;;关于PDMS三维模型重量估算的探讨[A];第十五届中国海洋(岸)工程学术讨论会论文集(上)[C];2011年
3 姜红静;杨永春;;PDMS在核电站管道设计中的应用[A];中国核科学技术进展报告——中国核学会2009年学术年会论文集(第一卷·第3册)[C];2009年
4 顾敏芬;叶永红;王昉;吴雯婷;梁忠诚;;PDMS的热固化特性研究[A];“国际化学年在中国”——中国化学会第三届全国热分析动力学与热动力学学术会议暨江苏省第三届热分析技术研讨会论文集[C];2011年
5 戴敬;樊晓峰;方肇伦;;PDMS复制的微流控芯片微结构尺寸的简易测量方法研究[A];第二届全国微全分析系统学术会议论文摘要集[C];2004年
6 田莉;何毅;;用鲎试剂检测血液保存液中的热原[A];中国输血协会第三届输血大会论文专辑[C];2004年
7 凌云;徐亚同;赵渝;朱文杰;;发光细菌法在食品安全性检测中的应用研究进展[A];中国生态学会2006学术年会论文荟萃[C];2006年
8 马超;赵广英;;免疫传感器在食品安全快速检测中的研究进展[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年
9 黄文坤;彭德良;贺文婷;;四种主要植物根结线虫的快速分子检测[A];植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集[C];2008年
10 吕虹;张国军;康熙雄;;应用恒温扩增方法进行诺如病毒检测的研究[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 宋红霞记者 段丽茜;14辆快检车巡查省会药品市场[N];河北日报;2007年
2 ;口中含块膜即可快速检测激素水平[N];医药经济报;2004年
3 记者 王晓欣;食品市场有了快速检测箱[N];河南日报;2006年
4 王岳坤 记者 何潭振;桐乡市工商局快速检测查获“问题银鱼”[N];中国食品质量报;2006年
5 潜工商;潜江工商快速检测设备显威力[N];湖北日报;2007年
6 张默许宏刚;启动快速检测 百姓买菜更放心[N];营口日报;2007年
7 记者 马怀华;全省工商系统食品安全快速检测工作现场会在鸡召开[N];鸡西日报;2008年
8 记者 刘浏;抽查25种食品 75.63%合格[N];成都日报;2006年
9 刘建群;温州加强快速检测队伍建设[N];中国工商报;2006年
10 本报记者 吴天飞何秀丽;一支烟,数秒毒死一只小白鼠[N];哈尔滨日报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张金玲;基于微流控芯片的免疫反应快速检测系统研究[D];复旦大学;2012年
2 汤琦;硅水凝胶互穿网络材料的制备与性能研究[D];东华大学;2010年
3 倪君辉;面向微流控系统的PDMS平面微阀微泵研究及应用[D];东华大学;2011年
4 陈翔;微流路医学诊断芯片的制作及研究[D];中国科学院研究生院(电子学研究所);2003年
5 王明;聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片研究[D];中国科学院研究生院(电子学研究所);2003年
6 于海霞;基于PDMS微流控芯片的组织液透皮抽取方法及系统研究[D];天津大学;2011年
7 王保保;先进制造系统PDMS研究[D];西安电子科技大学;2000年
8 耿照新;基于MEMS技术的微阀和微泵的设计与研制[D];中国科学院研究生院(电子学研究所);2007年
9 孙洪文;微纳压印关键技术研究[D];上海交通大学;2007年
10 陈信忠;石斑鱼病毒性神经坏死病研究[D];厦门大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 付其达;高聚物PDMS超声改性的实验研究[D];大连理工大学;2012年
2 徐飞;采用非接触电导检测的PDMS电泳微芯片[D];大连理工大学;2012年
3 孟祥英;PDMS微芯片通道表面修饰方法及其在氨基酸分离分析中的应用研究[D];南昌大学;2012年
4 赵巳茹;PDMS改性及防污抗菌性研究[D];大连海洋大学;2013年
5 王莉;纳米粒子功能化PDMS芯片在氨基酸分离中的应用[D];南昌大学;2010年
6 张宜文;基于PDMS通道内表面区域化学改性的表面张力微阀的研制[D];浙江大学;2011年
7 刘畅;基于PDMS的红细胞变形性微通道芯片研究[D];重庆大学;2010年
8 邓茂盛;有机硅改性聚氨酯胶粘剂的合成研究[D];中北大学;2010年
9 陈辉;基于PDMS的发电厂管道系统流体计算的实现[D];浙江大学;2010年
10 郭玲;基于PDMS薄膜的热驱动式微阀的研制[D];大连理工大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026