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富血小板血浆促进脂肪来源干细胞—支架复合物成骨的相关研究

冯自豪  
【摘要】:[研究背景与目的]骨缺损是临床上常见的症状,包括先天性和后天性。骨缺损的修复主要包括自体、异体骨移植和人工材料充填三种方法,但均有其自身无法克服的局限性。二十世纪八十年代,组织工程概念的提出为解决这-难题提供了新的思路和方法。由于骨缺损在临床上的常见性和治疗上的迫切性,使得骨修复成为目前组织工程研究中发展最快的领域。采用组织工程技术有望避免自体骨移植的缺点,利用自体具有成骨活性的种子细胞和可降解材料复合回植体内,并使用相关的细胞因子促进成骨,随着材料的逐步降解,植入的成骨活性细胞分泌细胞外基质,最终形成组织工程骨修复缺损,同时避免了自体骨供区的继发性损伤。组织工程骨的三大重要因素为种子细胞、支架材料和生长因子。脂肪来源干细胞因其分布广泛、来源充足、易于获取等优点成为组织工程种子细胞的优先选择之-。β-磷酸三钙的主要成分与入骨的无机成分相似,是比较理想的骨组织工程人工支架材料。富血小板血浆制备简单,并含有高浓度的生长因子,是目前自体生长因子的主要来源,其含有的多种因子在促骨组织修复、加快新骨形成中具有极为重要的作用。亲和素-生物素桥接系统是近几年发展很迅速的-门生物学技术,两者之间的共价键是迄今为止发现的最稳定的共价键,可以促进细胞在支架上早期粘附,有利于细胞的增殖。本实验在对脂肪来源干细胞和β-磷酸三钙的研究基础上,采用脂肪来源干、细胞和生物素-亲和素系统修饰的β-TCP支架复合富血小板血浆在动物体内异.位及原位分别构建组织工程骨,并研究富血小板血浆对促进成骨的作用。[材料与方法](一)脂肪来源干细胞分离、鉴定、培养和诱导分化(1)自新西兰大白兔的腹股沟切取脂肪组织,经常规酶消化法提取脂肪来源干细胞,观察细胞形态;(2) 采用单克隆抗体标记ADSCs,然后采用细胞免疫组化测定干细胞表面标志物:CD29.CD34.CD44.CD105等;(3) 通过诱导分化剂的诱导,将ADSCs诱导分化成脂、成骨,通过油红0染色、碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色了解干细胞成脂、成骨情况。(二)β-磷酸三钙支架的制备及特性鉴定(1)以硝酸钙和磷酸氢二铵溶液为原料,液相沉淀法制备纳米级β-TCP粉体,以氯化铵为造孔剂,程序升温法烧结成纳米级多孔β-TCP支架材料;(2)对材料的物相进行X线衍射、傅里叶红外线转换光谱分析仪测试,万能试验机测定材料的抗压强度,液体静力称量法测定材料的孔隙率和吸水率;(3)对材料的微观结构进行扫描电子显微镜观察。(三)生物素-亲和素系统促进脂肪来源干细胞在β-磷酸三钙支架上粘附的研究(1)用CCK-8法检测多孔β-TCP支架提浸液毒性;(2)利用免疫荧光以及流式细胞仪检测ADSCs生物素化的效率;(3)采用CCK-8法检测ADSCs与多孔β-TCP支架、生物素-亲和素系统修饰ADSCs与多孔β-TCP支架的粘附效率;(4)采用扫描电镜检测ADSCs与多孔β-TCP支架、生物素-亲和素系统修饰ADSCs与多孔β-TCP支架材料的表面情况。(四)富血小板血浆促进脂肪来源干细胞与9-磷酸三钙支架裸鼠体内异位成骨的研究(1)两次离心法制备富血小板血浆;(2)实验分为四组:β-TCP组、β-TCP+PRP组、ADSCs+β-TCP组及ADSCs+β-TCP+PRP组,在裸鼠背部皮下异位成骨;(3)8周后取出标本行苏木精伊红(HE)染色及骨钙素(OCN)染色,进行组织学观察。(五)富血小板血浆促进脂肪来源干细胞与β-磷酸三钙支架修复兔下颌骨缺损的研究(1) 本实验采用新西兰大白兔,共6只分为两组,包括A组(对照组):ADSCs+β-TCP组;B组(实验组):ADSCs+β-TCP+PRP组。在兔下颌骨体制作骨性缺损,用材料复合物进行修复;(2)在实验第4周时处死兔,并行头颅CT平扫,观察支架与周围骨的融合情况;(3)4周后取出标本行苏木精伊红(HE)染色及骨钙素(OCN)染色,进行组织学观察:(4)荧光定量RT-PCR测骨钙素(OCN),碱性磷酸酶(ALP)的表达量。1.自新西兰大白兔腹股沟切取脂肪,经常规酶消化法分离培养的细胞,具有干细胞的形态和特性,经细胞免疫组化检测其表面标志物的表达为CD29,CD44,CD105呈阳性表达,而CD34表达呈阴性表达;经定向诱导分化,发现ADSCs具有成脂、成骨多向分化的潜能。2.支架材料成分为β-TCP,晶粒尺寸31.5nm,孔隙率71.26±0.28VoI%(n=5),吸水率38.51±0.21Wt%(n=5),抗压强度7.93±0.06MPa(n=5),孔隙均匀丰富,连通性好。3.ADSCs与多孔8-TCP支架提浸液浓度100%、50%、10%、1%的相对增长率分别为107.48±10.32%、105.63±9.85%、108.51±12.06%、109.04±8.17%。生物素化的ADSCs荧光染色显示生物素结合部位在细胞胞质,且流式细胞仪检测提示生物素化细胞阳性率为95%。不同时间点(10分钟、30分钟、60分钟、12小时、24小时)ADSCs与多孔 β-TCP支架、生物素-亲和素系统修饰ADSCs与多孔β-TCP支架材料的粘附率分别为2.31±0.14%vs21.75±4.69%,11.96±2.53%vs54.82±12.37%,33.48±9.51%vs78.69±15.65%,78.29±10.63%vs95.46±7.38%,94.79±10.42%vs98.13±1.45%。4.裸鼠体内构建异位组织工程骨的A组(β-TCP组)与B组(β-TCP+PRP组)的苏木精伊红(HE)染色及骨钙素(OCN)染色仅有极少量细胞及成骨细胞外基质着色。但是C组(ADSCs+β-TCP组)与D组(ADSCs+β-TCP+PRP组)的的HE染色及OCN染色可见大量细胞及成骨细胞外基质着色,且D组比C组更为明显。5.兔下颌骨缺损修复实验中头颅CT三维成像显示支架与周围骨的融合较好。苏木精伊红(HE)染色及骨钙素(OCN)染色显示更多细胞及细胞外基质着色,实验组比对照组更为明显。6.兔下颌骨缺损修复实验中对A组(ADSCs+β-TCP组)与B组(ADSCs+β-TCP+PRP组)上ADSCs的cDNA进行PCR扩增反应,检测两个样本骨钙素(OCN),碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达水平。A组的OCN表达值为17.49±3.52,B组的OCN表达值为26.38±7.17;A组的ALP表达值为15.12±4.21,B组的ALP表达值为49.62±8.34。B组均优于A组。1.脂肪来源干细胞分离培养简单,获取容易,干性强,传代稳定,具有多向分化的潜能。2.实验制备的纳米级β-TCP粉体反应完全,无杂质,晶粒细腻,烧结出的纳米级多孔β-TCP支架材料具有良好的孔隙结构和孔隙连通性,并具备一定的抗压强度,可以作为支架材料为进一步的实验所使用。3.多孔β-TCP支架提浸液对ADSCs并无细胞毒性作用,细胞与支架生物相容性好。生物素-亲和素系统修饰的ADSCs和β-TCP支架可以促进ADSCs在支架上早.期粘附。4.在裸鼠皮下异位成骨实验及兔下颌骨缺损修复实验中,ADSCs+β-TCP+PRP组合可构建组织工程骨。5.在裸鼠皮下异位成骨实验及兔下颌骨缺损修复实验中PRP能起到加速成骨的作用。


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