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《复旦大学》 2014年
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基于功能性纳米材料的肽组学富集及蛋白质高效酶解的新方法研究

万丹  
【摘要】:蛋白质是生物体生命现象中的直接体现者,对其的研究具有重大意义,如果能够研究清楚蛋白质的结构和功能,明白蛋白与蛋白之间的相互作用,确定蛋白质在不同环境下表达的差异性和在特定通道、细胞结构中的作用,那也就能解释生命在生理或病理条件下的一些变化机制。因此,我们需要发展更多更好的蛋白质组学研究技术和方法,为生理学、药理学、病理学等方面提供重要的依据。在蛋白质组学的研究中,首要问题就是发展一种高效快速的酶解方法将蛋白切成肽段,再进行质谱的分析检测。而在肽组学的研究中,目前存在的问题主要是由于复杂的生物样品中通常含有高浓度的盐、高丰度蛋白,这会严重影响目标肽段的分析,所以要寻找到一种适当的分离富集技术来规避这些不利因素。近几年来,功能化纳米材料的快速发展,使得其在各个领域都有着很好的运用,相较于普通材料来说,它们具有更大的比表面积和特定的功能,极其适用于生物医学领域。而以这些纳米材料为基底,可以进行一些特殊的修饰,将其运用于蛋白/肽组学研究中,大大地简化实验所需的步骤。本论文针对蛋白质组学/肽组学研究中面临的选择性富集和高效酶解方面的热点难点问题,将功能性纳米材料与蛋白/肽段的分析结合起来,开展了一系列的研究工作,发展了一些基于功能性纳米材料蛋白质/肽段研究的新技术新方法,并且将其应用于复杂的实际生物样品中,进一步验证了该新技术新方法的可行性,也取得了一些创新性研究成果,为蛋白质的高效酶解和肽段混合物的选择性分离富集提供了新颖有效的研究手段和方法,充分展现了其在复杂生物样品中运用的巨大潜力。第一章中中主要阐述了蛋白质组学和肽组学的重要研究意义,并且详细介绍了目前用于蛋白质组学研究的技术。接下来综述了功能性纳米材料在蛋白质酶解中的运用,包括酶固定的技术和一些酶解蛋白的方法。另外还概述了纳米材料在肽组学分离富集中的运用和生物质谱在蛋白质组学和肽组学研究中的新技术新方法。在本章的最后提出了本论文的选题意义。第二章中介绍了一种以石墨烯作为基质,结合纳米金和MALDI-TOF-MS来高效快速检测谷胱甘肽(GSH)的新方法。利用Au-S键的作用,可以特定性地捕获到GSH,达到选择性分离富集的效果。甚至当GSH浓度低至0.625 ng/μL时,也具有很好的分析结果。与之前报道的检测GSH方法相比较,本章中提出的方法具有诸多的优势,实验操作简单,能节约很多的时间、精力,同时也具备很好的富集效率,因为它能大大地减少待测分析物的损失。另外该方法也已经成功地运用于富集检测鼠肝提取液中的GSH,通过这一系列的实验结果证明实验中提出的该方法在生物化学和医学研究领域中具有很大的运用潜力。第三章中我们制备了一种新型的Tips,可以从肽段混合物中灵敏地捕获到含巯基肽段。这是因为含巯基肽段和纳米金之间存在着很强的作用力。我们的Tips制备起来非常地简单快速,而且能够重复使用。根据样品量的多少,也可以选择不同厚度和直径的Tips。所有的实验结果也表明其能够灵敏地捕获到含巯基肽段,甚至当含巯基肽段和不含巯基肽段质量比为1:100时,也能很好地检测到目标肽段。用该方法来分离富集含巯基肽段,实验步骤简单方便,整个实验过程大约需要3分钟,这也显示着其今后在蛋白质组学样品预处理研究方面的巨大潜能。第四章中介绍了表面修饰Trypsin的磁性氧化石墨烯(Fe3O4@Graphene Oxide@Trypsin)的设计与制备,我们首先通过一种简单的溶剂热方法合成了磁性氧化石墨烯(Fe3O4@Graphene Oxide),再将其成功用于Trypsin的固定,通过红外表征确定其成功地修饰在其表面。由于氧化石墨烯具有巨大的比表面积和很强的亲水性,使得表面固定酶的浓度高达395μg/mg,远远高于其他文献中报道的数值。另外仅仅在激光辅助酶解5s的情况下,就能够具有非常好的酶解效率,可以跟传统的水溶液中酶解效果相当。将其运用于复杂的生物样品中(鼠脑提取液),实验结果发现在酶解15min后,鼠脑提取液中一次可以鉴定出1080个蛋白。一系列的实验结果都表明本文中合成的这种Fe3O4@Graphene Oxide@Trypsin复合材料具有很好的蛋白酶解效果,提供了一种新的高效快速酶解的新技术。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:TB383.1;O629

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