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《复旦大学》 2014年
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基质金属蛋白酶-3基因启动子区多态与散发性脑动静脉畸形的遗传易感性分析与功能研究

宋剑平  
【摘要】:[目的]探索基质金属蛋白酶-3(Matrix metalloproteinases 3, MMP3)基因启动子区多态与散发性脑动静脉畸形(Brain arteriovenous malformation, BAVM)的遗传易感性,并研究MMP3基因启动子区单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)的生物学功能。[方法]MMP3是基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMP)家族中的重要成员,具有降解细胞外基质的功能,参与血管重塑与再生,可能在BAVM的发生发展中起重要作用。本课题首先通过数据库检索,选择了5个在中国人群中高频分布的潜在MMP3基因功能性SNP位点,通过病例-对照进行研究。经检测319例BAVM患者和333例健康对照组的血液标本,确定了与BAVM发病相关的MMP3基因启动子区SNP位点-709AG(rs522616)。其次,对该位点AG突变降低BAVM发生风险的分子机制进行了探索。本课题采用构建含有-709A、-709G以及位点突变的pGL3-A、pGL3-G和]pGL3-mutant荧光素酶报告载体,分别转染HEK293和HUVEC细胞,检测荧光素酶活性,分析该SNP位点不同等位基因所导致的MMP3基因转录活性的不同。再通过添加含有-709A、-709G的竞争性DNA片段,分析pGL3-A受干扰后的转录活性,比较这两种等位基因与转录因子之间结合力的强弱。然后通过生物信息学软件确定与该MMP3基因启动子区SNP结合的转录因子为c-myb,并通过构建其过表达荧光素酶报告载体共转染、染色质免疫共沉淀和凝胶迁移实验,检测c-myb对MMP3基因转录活性的影响,并在BAVM组织中进行验证。[结果]通过分子流行病学调查,BAVM病例组与对照组在年龄和性别上分别匹配(p=0.0620.945),没有统计学差异。在检索分析获得的5个SNP位点中,MMP3基因启动子区-709bp SNP位点rs522616AG在BAVM病例和对照组中存在显著差异(P=0.02),携带rs522616AG杂合基因型的个体与AA基因型携带者相比,BAVM的患病风险降低了38%(Adjusted OR= 0.62,95% CI= 0.44-0.87, P= 0.006)。转录活性实验证实,在HEK293细胞中,G等位型的荧光素酶活性较A相比显著下降了2.67倍(P0.01);在HUVEC细胞中,G等位型也下降了5.89倍(P0.05)。在竞争实验中,A比G竞争片段可以更大程度降低pGL3-A转录的荧光素酶活性(Aportion vs G portion=0.503-fold vs 0.756-fold, P=0.01)。提示AG的突变降低了MMP3基因启动子区的转录活性以及与转录因子的结合力。通过生物信息学检测,发现在MMP3基因启动子区SNP rs522616周围6个碱基TTCAAT是转录因子c-myb的结合位点,在细胞水平上过表达c-myb,可以使得pGL3-A的荧光素酶活性在HEK293及HUVEC细胞中分别提高了1.7倍和1.2倍(P0.05),而不能明显提高pGL-G的转录活性。染色质免疫共沉淀和凝胶迁移实验证实了在细胞系以及BAVM组织中,转录因子c-myb与包含-709A等位型的MMP3启动子区域结合更为紧密。[结论]本研究首次提出MMP3基因启动子区SNP -709 AG (rs522616)可能可以降低BAVM的发病风险,该保护作用的机制在于-709 AG的突变能减弱MMP3基因启动子与转录因子c-myb的结合能力,继而影响转录活性,从而减少MMP3基因的过表达。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R743.4

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