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《复旦大学》 2003年
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角膜上皮在角膜移植排斥反应中作用的研究

王艳  
【摘要】: 角膜上皮、基质和内皮这三层角膜主要结构,在角膜移植排斥反应中所起的作用并不相同。由于角膜中的大部分移植抗原都表达于角膜上皮,因此众多研究认为上皮在排斥反应的诱导过程中有重要的作用,但由于在角膜移植中刮除供体上皮并未提高植片的存活时间,这又使人们对上皮在角膜移植排斥反应中的作用产生了怀疑。明确上皮在排斥反应中的作用,不仅能进一步明确排斥反应的理论,而且将有利于指导手术方法的改进,为降低排斥反应的发生提供新的思路。在以往的研究中研究者通过刮除供体上皮减少异基因抗原的含量,但是同时也使基质丧失了完整上皮的覆盖和保护,所以结果并不完全可靠。本研究借鉴LASEK技术,对不同酒精浓度和作用时间进行筛选,选定20%酒精浸润中央角膜3.5mm直径范围1min,作为制作角膜上皮瓣的安全浓度和时间。在角膜移植术中,首先制作受体的上皮瓣,并以此瓣覆盖于去上皮的供体植片上,在保证完整上皮覆盖的条件下对上皮在角膜移植排斥反应中的作用进行了研究。结果发现,供体上皮在诱导排斥反应中具有重要的作用,保留受体上皮可以明显延长植片的存活时间。 第一部分 不同浓度酒精对大鼠角膜组织损伤作用的研究 目的:研究为制作角膜上皮瓣所选用的不同浓度酒精对角膜组织的可能损伤作用,指导选择合适的酒精浓度制作安全可靠的上皮瓣。 方法:以近交系Wistar大鼠为对象,进行以下研究:1) 15%、20%、30%、40%四个不同浓度的酒精分别在大鼠角膜中央3.5mm直径范围内浸润1min,生理盐水充分冲洗后取眼球,制作石蜡切片,分别行HE和PAS染色;其中20%、40%酒精处理1min后的角膜,还进行透射电镜观察;2) 20%酒精分别在大鼠角膜中央3.5mm直径范围内浸润30s、1min、2min,生理盐水充分冲洗后取眼球,制作石蜡切片,分别行HE和PAS染色;3) 20%酒精在大鼠角膜中央3.5mm直径范围内浸润1min,生理盐水充分冲洗,3d后取角膜分别进行光镜和透射电镜观察以及角膜郎格罕(Langerhans,LGs)细胞免疫组织化学染色; 4) 比较不同浓度酒精制作上皮瓣的难易程度,选择制作容易而又损伤最小的浓度和作用时间制作上皮瓣。上皮瓣和去上皮角膜进行HE和PAS染色光镜观察以及透射电镜观察。 结果:1)不同浓度酒精处理角膜1min:15%酒精对角膜各层细胞形态未产生明 WP=6 显的影响;20%酒精引起表层角膜上皮细胞核浓缩,翼状细胞层和基底层角膜上皮、上皮基底膜、角膜基质和内皮均未见改变,电镜观察见表层角膜上皮细胞间连接疏松,有的连接断开,细胞核有浓缩改变,其余结构无明显改变。30%酒精引起角膜上皮细胞间和上皮下大泡,翼状细胞层核固缩,基底细胞无明显改变,局限性上皮基底膜破坏,基质和内皮无明显改变。40%酒精引起角膜上皮细胞核固缩,累及上皮基底细胞,上皮广泛与基质分离,电镜观察角膜上皮细胞间连接疏松,表层上皮脱落,可见上皮细胞膜破坏,基底上皮细胞内有空泡结构,基质和内皮未见明显改变。2)20%酒精处理角膜不同时间:处理30s对角膜各层细胞形态无明显影响,处理2min见上皮细胞间积水,翼状细胞层细胞核固缩,上皮基底膜局限性破坏,基质和内皮无明显改变。3)20%酒精处理1min,3d后角膜上皮细胞恢复正常,透射电镜观察细胞间连接恢复,免疫组化染色显示LGs细胞分布与正常无差别。4)15%酒精处理角膜上皮1min,完整上皮瓣难以制作,20%及其以上浓度酒精处理1min可以较容易的制作完整上皮瓣。光镜观察20%酒精处理1min剥除的上皮瓣,见到完整的上皮细胞层以及和上皮相连的前部基底膜,剩余角膜基质和内皮无形态改变,电镜观察可见后部基底膜完整的保留在角膜基质前表面。 结论:1)不同浓度酒精不同时间浸润角膜上皮,可松解和破坏上皮细胞之间的连接,影响角膜上皮细胞的屏障功能,甚至造成角膜大泡;可以引起细胞膜破损,细胞核固缩等病变,但一定时间内的作用不会对基质和角膜内皮产生损害。上皮损伤作用呈浓度时间依赖性。2)20%酒精浸润角膜上皮1min,仅表层上皮轻度损伤,并且损伤易于恢复,不对角膜LGs细胞分布产生明显影响,是制作完整角膜上皮瓣的合适酒精浓度和时间。 第二部分 角膜上皮在角膜移植排斥反应中作用的研究 目的:研究角膜上皮在角膜移植排斥反应中的作用,以及保留受体角膜上皮对角膜植片的影响。 方法:分别以近交系F344大鼠和Wistar 大鼠为供受体进行穿透性角膜移植。实验动物随机分为6组。A组:保留供体上皮的同基因角膜移植;B组:去除供体上皮的同基因角膜移植;C组:保留受体上皮的同基因角膜移植;D组:保留供体上皮的异基因角膜移植;E组:去除供体上皮的异基因角膜移植;F组:保留受体上皮的异基因角膜移植 。术后每天裂隙灯观察,观察期28d。记录各组排斥反应发生的时间,排斥反应发生后不再进行观察。A、B、C三组分别在术后 WP=7 3d、7d、14d、28d处死2只大鼠,D、E、F三组分别在术后10d处死3只大鼠。取出眼球OCT包埋,液氮速冻,进行冰冻切片。每组各时间点标本除进行HE染色外,A、B、C三组3d 和14d标本进行VEGF和 LGs细胞免疫组织化学染色,D、E、F三组进行CD4、CD8、RT1B抗体检
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R779.65

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