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《复旦大学》 2003年
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组织因子在胶质瘤中的表达及其促血管生成作用的研究

关明  
【摘要】: 组织因子(tissue factor,TF) 是一跨膜糖蛋白,分子量为47KD。它既是凝血因子VII(FVII)的细胞表面受体,又是FVII或激活的FVII(FVIIa)的辅因子。它与FVII或FVIIa形成复合物,继而激活凝血因子X(FX)或凝血因子IX(FIX),同时启动内外两条凝血途径,在生理性止血中起重要作用。它分布于各种不同的细胞中,包括血管内皮细胞及白细胞、成纤维母细胞、单核细胞和类单核细胞等。 人TF含263个氨基酸残基,整个分子分为三部分:细胞膜内为21个氨基酸残基;跨膜部分为23个氨基酸残基,具有疏水性;膜外部分含219个氨基酸残基,为氨基端,带有糖链,呈亲水性,也叫可溶性TF(soluble TF, sTF)。TF的分子结构显示它属于II类细胞受体家族,α、β和γ干扰素的受体就是这个家族的成员。 除了它广为人知的在凝血系统中的作用外,TF也参与许多细胞的生理病理活动,比如细胞信号传导、细胞增殖和血管发育等,特别是与肿瘤的血管生成和转移密切相关。如果在鼠的胚胎组织中敲除TF基因,会导致卵黄囊血管膜不能发育造成胚胎死亡,显示了TF在生理情况下的血管生成作用。某些病理变化使细胞失去对TF表达的严格控制,从而造成TF的异常表达。例如许多肿瘤细胞,包括白血病患者肿瘤细胞,能大量表达TF,这也是这些患者体内通常伴随着高凝状态的原因。在某些实体瘤中也发现TF的表达与恶性级别密切相关,这些肿瘤包括:胰腺癌、直肠癌、乳腺癌、胶质瘤等。 自从70年代Folkman 首次证明实体瘤必须依靠血管增生才能长成几毫米的大小,这些年来人们陆续发现了一些生长因子(包括TF)与血管生成有关系。在小鼠肉瘤中高表达TF能上调有强烈促血管生成作用的血管内皮细胞生长因子(vescular endothelial growth factor, VEGF)下调抑制血管的血小板生成素(thrombospondin-2, TSP-2)的产生。对多种乳腺癌和黑色素瘤细胞系中VEGF和TF含量测定显示两者的水平高度相关,对肺癌和乳腺癌肿瘤标本的原位杂交分析也均证明了这两种因子的共表达现象。将TF 和VEGF高表达的黑色素瘤细胞株以及TF 和VEGF 低表达的黑色素瘤细胞株接种到复合免疫缺陷小鼠皮下,TF 和VEGF 高表达的细胞株在注射后8 至10 周内出现了高度血管化的肿瘤,TF 和VEGF 低表达的细胞株则形成血管化程度很低的肿瘤。在转移性人黑色素瘤的小鼠模型中,内源性TF表达水平与肿瘤转移潜能相关。将携有人TF 的cDNA的腺病毒转染至非转移性的人黑色素瘤中,可使 WP=5 瘤细胞变得有转移性。 尽管有越来越多的报道肿瘤与TF之间的关系,甚至TF被某些学者认为是可媲美前列腺特异抗原(prostate specific antigen, PSA)、癌胚抗原(carcinoma embryonic antigen, CEA)的肿瘤标志物之一,然而直到现在人们还不清楚TF是如何促进肿瘤的生长?TF是不是通过促进VEGF的表达来表现其促血管生成活性的?TF对其他血管因子是如何调节的? 胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤,占中枢神经系统肿瘤的1/3,其恶性表型以局部侵袭和血管生成为主要特征。肿瘤的血管生成与转移、浸润有密切的联系,也是评估预后的一个指标。因此血管化是胶质瘤从晚期到浸润、侵袭这一阶段必不可少的环节,综观近年来TF的研究进展和趋势,我们发现目前国内外尚未见对胶质瘤中TF的表达与肿瘤的生长、浸润、血管生成的关系及其机制的探讨的研究报道。鉴于TF在肿瘤中的作用的研究日益深入,有必要对胶质瘤中的TF的表达和其可能扮演的角色作一研究。 ⑴ 检测TF mRNA的荧光定量PCR方法建立 不断有证据显示TF在许多肿瘤细胞中表达,并在肿瘤的发展和转移中具有重要的作用。荧光定量PCR技术是近年来涌现的定量mRNA的新技术,然而有关TF基因的荧光定量PCR测定方法还未见报道。本研究基于TaqMan 荧光探针技术,建立了实时RT-PCR方法来检测TF的表达。构建了含有TF片段的质粒作为标准模板,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板。本方法动态检测范围为103~108 拷贝/(g RNA(r2≥0.99), 对低值的批内、批间的重复性分别为16.2%和20.0%,高值分别为6.3%和10.2%,这种方法简单、快速,比传统的Northern blot和竞争PCR法更优越,适用于大规模的临床应用。 ⑵ TF在胶质瘤中的表达和血管生成的关系 在许多恶性实体瘤中也发现TF的表达与恶性级别密切相关,TF表达似乎也是这些肿瘤中血管浸润的一个标志物。然而TF在胶质瘤的表达与血管浸润的关系还不清楚。通过免疫荧光和实时荧光定量PCR研究34例不同恶性分级的胶质瘤、5例正常人脑组织和U251胶质瘤细胞系中TF的蛋白、基因表达水平,并采用血管性假性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)作为内皮细胞标记物来检测微血管密度。无一例正常组织表达TF。90%的IV级肿瘤、58%的II级肿瘤、43%III级肿瘤和 20%Ⅰ级肿瘤都表达TF。免疫组化显示TF的表达与血管密度有相关,TF表达的阳性肿瘤的血管数与TF表达阴性的肿瘤的血管数有显著性差异。荧光定量RT-PCR检测发现肿瘤组织均有mRNA的存在,范围从1.7×105~6.8×107拷贝/(gRNA ,均值为4.6×106拷贝/(gRNA ,且拷 WP=6 贝数与恶性程度成正比;检测5例正常脑组织,均值为5.0×103拷贝/(gRNA;检测胶
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R73-3

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