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《复旦大学》 2003年
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转基因神经干细胞移植对脑缺血后神经血管保护作用的研究

朱巍  
【摘要】: 目的:观察神经干细胞在宿主脑缺血半暗区的存活、迁徙、分化情况,以及对脑缺血后神经功能损害的修复作用。检测经脂质体介导法转染VEGF基因的神经干细胞在宿主缺血区的基因表达情况,以及对神经、血管的保护作用。探讨转基因神经干细胞移植治疗脑缺血性疾病的作用。 材料和方法:取孕14天胎鼠海马组织,经机械消化后,在无血清、含生长因子和细胞辅助剂,以及低细胞密度的生长环境中培养并传代。单细胞克隆纯化细胞。扩增pcDNA-3/VEGF121质粒,并进行测序和校对。通过脂质体介导法将VEGF121基因转染到神经干细胞中。转染后2周内,RT-PCR半定量检测神经干细胞的基因表达-时间曲线。免疫荧光染色检测神经干细胞及其分化细胞的基因表达情况。建立大鼠暂时性大脑中动脉阻塞模型(tMCAO),按神经损害严重程度评分(NSS)对缺血后神经功能进行评定,并随机分成对照组、细胞悬液(PBS)移植组、神经干细胞移植组和转基因神经干细胞移植组。3日后,将BrdU标记的神经干细胞和转基因神经干细胞经立体定向分别移植到tMCAO大鼠的纹状体缺血半暗区。移植后2、4、6、8、10、12周对各组进行NSS评分。移植后1周免疫荧光染色观察转基因神经干细胞在脑内的基因表达情况。移植后12周免疫荧光染色观察神经干细胞在脑内的分化、迁徙情况,免疫组化观察移植区的血管结构破坏情况和血管内皮细胞数量。 结果:培养获得高纯度的神经干细胞,这些细胞nestin标记呈阳性,并具有自我更新和多向分化潜能。VEGF121基因经Lipofectamine介导被转染至神经干细胞内。RT-PCR检测显示转基因神经干细胞体外表达VEGF121达两周左右。免疫荧光显示转基因神经干细胞及其分化的子代细胞均有VEGF121的表达。各组大鼠tMCAO模型建立时NSS评分无显著性差别。移植后2、4、6、8、10、12周转基因神经干细胞移植组NSS评分均低于其它三组。移植后8、12周神经干细胞移植组NSS评分亦低于对照组和PBS移植组。移植后1周免疫荧光染色显示转基因神经干细胞在宿主脑内迁徙并表达VEGF基因产物。移植后12周免疫荧光染色显示移植后的神经干细胞在宿主脑内存活、迁徙,部分分化成成熟神经元并与宿主细胞良好整合。免疫组化染色显示转基因神经干细胞移植组移植区毛细血管结构相对完整、血管内皮细胞数多于其他各组。 结论:神经干细胞移植对改善脑缺血后期的神经功能状况具有一定的作用。转染VEGF的神经干细胞移植后在缺血早期表达基因产物,并对宿主局部血管和神经结构具有保护作用。转基因神经干细胞移植是治疗脑缺血性疾病的可行途径。 创新之处:1、利用非病毒介导技术转染治疗基因的神经干细胞进行脑缺血治疗 WP=4 研究;2、充分利用神经干细胞的生物学潜能,同时从血管保护和神经修复两方面来探讨脑缺血的治疗机制。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R743.3

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