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《复旦大学》 2004年
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肝癌预防、早期诊断及发生机制中三个相关问题的探讨

黄兴华  
【摘要】:本文分三个部分, 分别从肝癌的预防、诊断及基础研究的角度去探讨肝癌 发生、发展及转移的分子机理,试图为肝癌防治解决一些具体问题。第一部分针 对江苏启东肝癌高发地区乙肝疫苗预防工作中出现的疫苗逃脱现象,分析了可能 存在的几种原因,指出乙型肝炎病毒 S 基因中“a”决定簇编码序列发生点突变 是该地区疫苗逃脱现象的原因之一,并提示了预防疫苗逃脱变异的重要意义;第 二部分分析了游离于不同肝病患者血浆中肝细胞 p53 基因第七外显子 249 密码 子的突变情况,指出该分子标记可作为江苏启东肝癌高发地区肝癌早期诊断的一 项新指标;第三部分研究了肝癌异常表达基因 RTN4B 和 RTN4C 的初步功能,指 出肝癌特异表达蛋白 RTN4B 不仅可作为肝癌病理诊断的一项标记,而且有可能 在肝细胞癌变过程中介导了一条新的信号通路。 一、 乙型肝炎病毒(HBV) 的感染是启东高发地区肝癌的主要诱因。预防 HBV 的感染是阻止原发性肝癌(HCC)发生的一个最重要的策略。1980 年代,在 江苏实施了一项重大的计划,80,000 名出生于 1984 至 1990 年之间的新生儿童 接种了乙肝疫苗。三次随访后的结果发现,尽管这批儿童受到了疫苗的保护,仍 有 15 名呈疾病症状,表现为血清谷丙转氨酶(ALT)的持续高水平。其中,5 名 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阴性个体的ALT水平显著地比10名HBsAg阳性个 体的 ALT 水平高。我们采集了这 15 名儿童的血样,分别提取了血清中 HBV- DNA, 设计引物并克隆了 HBsAg 编码序列。测序结果显示, 5 名 HBsAg 阴性个体表面 抗原“a”决定簇编码序列中 530,540,544,558,560,561,587 位 (从 HBV 基因 组 的 EcoRI 位 点 算 起 ) 发 生 不 同 的 点 突 变 , 导 致 从 HBsAg 开 始 的 126,129,135,136,145 位氨基酸发生改变。我们发现,在 7 个点突变中,有 6 个 发生在“a”决定簇内第一个环状结构的编码序列中,导致 “a” 决定簇的 126,129,135,136 位 4 个氨基酸残基分别发生替换,1 个发生在“a”决定簇内第 二个环状结构的编码序列中,导致 145 位热点突变(Gly → Arg)。“a”决定簇 的双环构象非常保守,并且对 HBV 的抗原性很重要。双环构象中的这些改变能逃 脱疫苗诱导抗体的中和作用。 二、 中国启东地区肝癌的特征之一是 p53 基因的选择性突变,导致 249 密 码子处发生丝氨酸替换。这一突变已被确认为发生在黄曲霉毒素高暴露人群及携 带乙型肝炎病毒的高危人群中的一个热点突变。本文对于在中国启东地区肝细胞 8 WP=7 复旦大学博士学位论文 前言 癌及肝硬化病人中游离于血浆的 DNA 中能否检测到这种热点突变作出了评估,并 试图说明检测这种分子生物标志的意义。 我们在启东地区采集了 25 例肝癌病人,20 例肝硬化患者及 30 例健康人的血 样。从各个全血样品的 200μl 血浆中分离 DNA,通过对 p53 基因第 7 外显子 PCR 产物的限制性消化分析及直接测序来检测p53基因249Ser突变。我们发现在10/25 (40%)的肝癌病人,4/20(20%)肝硬化患者及 2/30(7%)健康对照的血样中, p53 基因第 7 外显子 249 密码子第 3 碱基处发生 G→T 颠换,导致 249 密码子编 码的精氨酸变成丝氨酸。这些资料显示,血浆中 249Ser p53 突变与启东肝癌病人 密切相关。我们同时发现在启东的硬化患者及健康对照人中也能检测到的血浆 249Ser p53 突变,尽管他们的频率相当低。我们认为,该突变的检测结合常规的 诊断方法,可以为肝癌的早期诊断提供更多信息。血浆 249Ser p53 突变应开发成 为一种新的肝癌的早期诊断的标志。 三、 RTN(Reticulon)是一个多功能的基因家族。该家族中基因 所编码的蛋白主要定位于内质网。迄今为止,已发现的 RTN 基因家族有四个成 员,即 RTN1,RTN2,RTN3 和 RTN4。RTN4 是我们复旦大学遗传所人类新基因 研究室克隆到的一个基因。RTN4B 在 16 种正常人组织中表达情况的 Northern 杂 交分析已表明,该基因除肝脏以外的其余 15 种组织中均表达,在 12 对肝癌组织 的 Northern 杂交分析中,RTN4B 呈现显著的上调表达。而 RTN4C 在正常人肝组 织有表达,在 12 对肝癌组织的 Northern 杂交分析中,RTN4C 呈现显著的下调表 达。我们认为 RTN4B 和 RTN4C 是肝癌中异常表达的基因。 在这样的工作基础上,我们采用 Western 印迹技术分别对 RTN4B 和 RTN4C 基因在人肝癌及正常肝组织中的蛋白表达水平作了检测。利用 RT-PCR 方法分析 了 RTN4B 和 RTN4C 基因在大鼠模型中不同发育阶段的表达情况。这些表达谱分 析提示,RTN4B 基因的关闭与开启与肝癌的发生密切相关。 为探索 RTN4B 基因的生理功能,我们采用酵母双杂交的方法筛选 RTN4B 的 互作蛋白。结果发现 RTN4B 能与 BAP2-β[脑特异性血管生成抑制物 (brain-specific angiogenesis inhibitor, BAI1)的结合蛋白] 互作。BAP2-β是一种 胰岛素受体酪氨酸激酶的底物(IRSp53)。我们采用免疫共沉淀及细胞荧光共定 位的方法进一步验证了 RTN4B 与 BAP2-β之间的蛋白分子互作。RTN4B 的另一 互作蛋白为层粘连蛋白 LAMA4 。免
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R735.7

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