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《复旦大学》 2004年
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人类新基因BNIPL生物学功能的初步研究

沈利  
【摘要】:细胞增殖(cell proliferation)和细胞凋亡(apoptosis)是两种对立的最基本的细胞活动。在生理水平上这两种生命活动紧密相关、相互调节,它们的协调和平衡直接影响了细胞和组织的正常发育和体内的动态平衡,也影响了肿瘤的发生和发展。从分子生物学角度来看,肿瘤相关基因的表达与调控决定了肿瘤的增殖和凋亡。 Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 2-like, BNIP2-like (BNIPL)是上海市肿瘤研究所通过大规模功能筛选获得的影响细胞生长的人类新基因。该基因有5种亚型,通过SMART RACE的方法获得了其中两种的全长的cDNA序列,分别为BNIPL-v1和BNIPL-v2。序列分析表明,BNIPL-v1含有2147bp,BNIPL-v2含有2353bp,都有完整的3’端和5’端,起始密码子为ATG,起始翻译序列符合Kozak规律。BNIPL-v1开放阅读框含1074bp,编码357个氨基酸,预计分子量为39.7kDa;BNIPL-v2开放阅读框含828bp,编码275个氨基酸,预计分子量为30.9kDa。BNIPL-v1和BNIPL-v2在GenBank的登录号分别为AY033000和AF193056。蛋白质同源序列分析表明结果表明BNIPL-v1和人BNIP2、鼠BNIP2在蛋白质水平有68%的同源;BNIPL-v2和人BNIP2、鼠BNIP2在蛋白质水平有72%的同源。BNIPL蛋白含有两个保守结构域SEC14 domain和BCH domain。 BNIPL定位于染色体1q21.1区段,GFP融合蛋白亚细胞定位实验表明BNIPL蛋白在胞浆中表达,Norther杂交结果表明BNIPL在人的正常的肺和胎盘组织中高表达。虽然BNIPL含有酿酒酵母Sec14p的SEC14 domain,但是基因功能互补实验结果发现,在酵母细胞内BNIPL并不能与酿酒酵母Sec14p蛋白功能互补。利用酵母双杂交技术,通过筛选人肺cDNA文库,获得了4个与BNIPL相互作用的候选蛋白:巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF),生长因子(growth factor, ervl (S. cerevisiae)-like, GFER),核苷二磷酸激酶B(nm23-H2/NDP(Nucleoside diphosphate) kinase B)和FK506结合蛋白38(FK506 binding protein 38,FKBP38)。利用GST Pulldown和Co-immunoprecipitate实 WP=6 验分别在体外和体内验证了BNIPL可以分别和MIF、GFER、nm23-H2和FKBP38发生蛋白质的相互结合。 我们通过克隆集落形成实验和对细胞生长曲线的测定,研究发现BNIPL的过量表达能够抑制肿瘤细胞的生长,并且通过流式细胞术检测细胞膜表面磷脂酰丝氨酸的外翻变化,发现BNIPL具有促进肿瘤细胞凋亡的功能。因为BNIPL与其相互作用的蛋白FKBP38分别可以与Bcl-2结合,也就是说三种蛋白可以两两之间发生蛋白质的相互结合,分析认为BNIPL可能是参与了FKBP38-Bcl-2复合物的构成或者复合物定位的调控,抑制Bcl-2的功能,从而促进细胞凋亡。 为了进一步研究MIF、nm23H2与BNIPL的相互作用对细胞生长的影响,以及它们相互作用的生物学意义,我们利用Tet-on基因表达系统构建了可调控表达BNIPL,持续表达MIF或nm23-H2的Hep3B稳定细胞株。利用流式细胞术来研究BNIPL及其相互作用的蛋白MIF和nm23-H2分别表达和共同表达对细胞周期分布和细胞凋亡的影响。实验结果表明,BNIPL和nm23-H2分别具有促进细胞凋亡的功能,两者处于Bcl-2上游的两条不同的调控途径中,当BNIPL和nm23-H2共同表达并发生蛋白质相互作用时,两者相互抑制,表现为抑制细胞凋亡。 BNIPL参与细胞增殖的途径是与MIF、GFER发生蛋白质相互作用。我们主要研究了BNIPL与MIF的蛋白质相互结合,认为BNIPL对细胞增殖的抑制作用,主要是抑制了MIF的促细胞生长的功能实现的;反之,MIF也可以通过与BNIPL结合抑制由BNIPL诱导的细胞凋亡的产生。 本文的研究结果为进一步确定BNIPL基因在细胞增殖和细胞凋亡网络中的调控作用提供了一些有益的线索。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q987

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