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《复旦大学》 2004年
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Ⅰ型糖尿病的基因治疗研究

盛卫忠  
【摘要】:I型糖尿病又称为胰岛素依赖型糖尿病,属于自身免疫性疾病,是由于机体选择性攻击胰腺(细胞,造成(细胞大量破坏、胰岛素分泌严重不足,表现为高血糖和酮症酸中毒。近二十年来,我国糖尿病的发病率呈上升趋势,已成为继恶性肿瘤和心脑血管疾患后排第三位的慢性非传染性疾病。对于I型糖尿病目前可行的治疗方法主要包括:胰岛素注射,胰腺或胰岛移植。传统的胰岛素注射疗法不能提供足够的血糖控制,亦不能预防长期并发症的发生,并影响患者的生存质量。胰腺或胰岛移植被认为是治愈I型糖尿病的有效手段,但是供体不足、自身免疫反应、供体存活率低和代价昂贵等问题限制了这一疗法的广泛应用。 基因治疗通过一定的载体将治疗基因导入患者体内,使其表达有功能的蛋白产物,从而达到治疗疾病的目的。对于I型糖尿病而言,胰岛素基因治疗将是一种理想的治疗方式。通过将胰岛素基因导入不受自身免疫攻击的非β细胞,使之表达胰岛素,行使代替β细胞的功能,从而达到从根本上治愈I型糖尿病的目的。而一个成功的胰岛素基因治疗的系统至少应该包括以下4个重要组成部分:1、高效的胰岛素基因转移系统;2、根据血糖浓度调控胰岛素表达与释放的调控系统;3、选择一个有着类似β细胞生化特性的合适的靶细胞,同时该靶细胞又不是自身免疫攻击的目标;4、靶细胞中存在将胰岛素原加工成为成熟的、有生物活性的胰岛素的生化机制。 为此我们在获得能在非(细胞中表达成熟胰岛素的突变的人胰岛素原cDNA的试验基础上,研究具有葡萄糖应答能力的ACC PI启动子,将整合酶(c31及尾静脉液压法结合探索I型糖尿病基因治疗的新方法。 ACC PI启动子葡萄糖应答能力的实验研究 乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是长链脂肪酸生物合成的限速酶,ACC PI启动 WP=5 子呈组织特异性分布并具有葡萄糖应答能力。通过PCR方法获得大鼠ACC PI启动子序列,用它构建绿色荧光蛋白(GFP)和突变的人胰岛素原cDNA(mhINS)的表达载体,瞬时脂质体法转染L02细胞,检测不同葡萄糖浓度培养条件下细胞中目的产物的表达水平。结果ACC PI启动子在L02细胞中能够驱动目的基因的表达,表达量受葡萄糖浓度调控。在高糖培养条件下人胰岛素产量是低糖条件下的2.89倍。ACC PI启动子可以作为糖尿病基因治疗研究的有用工具。 整合酶ΦC31介导人胰岛素原cDNA治疗STZ糖尿病小鼠的实验研究 尾静脉液压法(Hydrodynamic)能够大大提高基因转移效率,并且将外源DNA高效地导入肝脏。而肝脏正是基因治疗的理想靶标之一。ΦC31位点特异整合酶系统能够实现外源DNA在宿主染色体上的整合,从而实现长期表达。应用尾静脉液压法将携带attB位点的、突变后的人胰岛素cDNA(mhINS)表达质粒pCMV-mhINS-attB及整合酶ΦC31表达质粒pCMV-Int同时导入STZ诱导的糖尿病小鼠体内,使mhINS表达框架位点特异地整合入小鼠染色体DNA中,持续表达胰岛素。质粒注射后,治疗组糖尿病小鼠血糖水平恢复正常并维持4周,血清胰岛素水平显著升高,小鼠体重增加,葡萄糖耐量试验接近正常。在DNA水平证实mhINS位点特异地整合入小鼠肝脏染色体假attP位点。免疫组化检测证实mhINS在小鼠肝脏有效表达。实验证明整合酶ΦC31具有介导外源DNA在体内的位点特异整合能力,与尾静脉液压法结合应用将是糖尿病基因治疗研究的有用工具。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R587.1

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