肝细胞癌病人血浆循环DNA浓度及其分子遗传学异常的临床意义研究

【摘要】：肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,90年代以来已成为我国第二位癌症杀手。尽管近年肝癌的临床治疗取得了很大的进展,部分早期诊断并得到及时治疗的病人获得了长期生存,但肝癌病人总的预后仍然不理想。其主要原因是手术切除后仍有相当比例的病人发生肝内复发或远处转移。常规组织学指标难以准确预测转移复发及病人预后。因此,临床上迫切需要一些生物学标志物(分子指标)能预测肝癌病人转移复发的可能,以利于肿瘤方案的个体化和及时有效的辅助治疗,以进一步延长病人生存。 组织学肿瘤标志物存在标本采集、无法连续检测和随访追踪等诸多限制,而体液(主要是外周血)肿瘤标志物具有检测方便和非侵入性等优点。已发现肿瘤病人外周血循环DNA的含量增加,伴有转移的肿瘤病人更高于早期病人,而且在循环DNA中可检测到与原发肿瘤细胞相一致的分子遗传学特征,为此,外周血循环DNA的分子遗传学检测逐渐被人们所重视。 有关肝细胞肝癌(HCC)病人血浆循环DNA的研究较少。我所牛旗等在HCC病人的血浆循环DNA中检测到被认为对乳腺癌转移复发有预测价值的D14S51和D14S52两个微卫星标志的杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH),并认为其与HCC病人的转移复发密切相关。但迄今尚未见有关血浆循环DNA定量检测在HCC诊断中的应用价值、血浆循环DNA定量及其遗传学异常,包括等位基因失衡(allelic imbalance,AI)、单核苷酸多态性检测(single nucleotide polymorphisms,SNPs)等,在HCC转移复发预测和预后监测等方面应用的报道。 我所前期工作发现,染色体8p缺失和HCC的转移有关。利用微卫星标记全基因组扫描进行等位基因失衡分析发现整个染色体8p存在不同程度的缺失,尤其在8p11.2和8p23.3更加明显,其中8p11.2上的D8S258和8p23.3上的D8S264两个微卫星位点AI的频率最高。吴欣等通过cDNA微阵列比较发现肝癌高转移细胞株在染色体8p上有10个表达序列标记(expressed sequence tags, ESTs)表达下 WP=5 调,可能与肝癌细胞的转移潜能有关。初步研究发现其中一个EST对应的HTPAP基因可能是一个抑制肝癌转移的候选基因。 在上述基础上,本研究旨在评价血浆循环DNA浓度以及血浆循环DNA中染色体8p上D8S258 (8p11.2)、D8S264 (8p23.3) 和D8S277 (8p23.1)三个微卫星位点的等位基因失衡和HTPAP基因的单核苷酸多态性在肝癌诊断、转移复发预测以及预后判断中的价值。 第一部分 肝细胞癌病人血浆循环DNA的定量分析 及其临床意义 本部分工作的目的是探讨血浆循环DNA定量分析在HCC诊断及转移复发和预后评估中的应用价值。 采集79例术前肝功能正常的HCC病人、20例代偿期肝硬化病人以及20例健康志愿者的静脉血,抽提血浆循环DNA。将血浆循环DNA与荧光染料SYBR green I 按比例稀释并充分混匀后通过紫外与可见光成像分析系统定量。受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve, ROC)及曲线下面积(area under the curve, AUC)用于判断血浆DNA浓度作为诊断标准的可行性。并进一步分析了血浆DNA浓度与HCC病人临床病理特征及预后的关系。 发现:HCC病人和肝硬化病人的血浆循环DNA浓度(47.1±43.7 ng/ml, 30.0±13.3 ng/ml)明显高于健康人群血浆循环DNA浓度(17.6±9.5 ng/ml),差异在统计学上有显著性(P=0.000;P=0.002)。但是,肝硬化组血浆循环DNA浓度与HCC组之间无显著性差异(P=0.191)。在HCC组中,伴肝内播散灶或脉管癌栓的41例病人的血浆循环DNA浓度(54.3±41.6 ng/ml)明显高于无肝内播散灶或脉管癌栓的38例病人(39.3±45.0 ng/ml,P=0.002)。采用36.6ng/ml(健康人群血浆循环DNA浓度的均数加2倍标准差)作为诊断HCC的临界值,发现其在健康人群中检测HCC的敏感度为51.9%,特异度为95%,AUC为0.80。而在含有肝硬化病人的非肿瘤人群中检测HCC的敏感度为51.9%,特异度为77.5%, AUC为0.70。 以36.6ng/ml为标准将79例HCC病人分为高浓度血浆循环DNA组(HDNA)和低浓度血浆循环DNA组(LDNA), 结果HDNA组59%的病人肿瘤直径超过 WP=6 5cm,明显高于LDNA组(29%,p=0.008)。HDNA组中49%的病人肿瘤TNM分期为III-IV期,多于LDNA(26%,p=0.040)。HDNA组的2年无瘤生存率(DFS)明显低于LDNA组(32% vs. 63%,p=0.010)。HDNA组的2年总体生存率(OS)也明显低于LDNA组(46% vs. 82%,p=0.001)。但血浆循环DNA浓度与HBsAg阳性与否、有无肝硬化、肿瘤数目、有无肿瘤包膜、Edmondson 分级和血清AFP浓度等无明显关系。多因素分析显示血浆循环DNA浓度是HCC病人OS的独立影响因素(p=0.020)。 提示:血浆循环DNA浓度不是诊断HCC的理想指标,但可作为HCC预后的预测指标。 第二部分 肝细胞癌病人血浆循环DNA中染色体8p 等位基因失衡及其临床意义 本部分研究的目的是分析血浆循环DNA中染色体8p上肝癌转移相关基因的等位基因失衡与HCC病人转移复发及预后的关系。 选择染色体8p上D8S258、D8S264和D8S277 三个微卫星标记对79例HCC病人的血浆循环DNA、相应的肿瘤和无瘤肝组织DNA,以及20例代偿期肝硬化病人和20例健康志愿者的血浆循环DNA进行AI分析。 发现:20例代偿期肝硬化病人和20例健康志愿者的血浆循环DNA在三个位点上均未测及AI。在79例HCC病人血浆与肿瘤组织标本中,94.9%(75/7