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《复旦大学》 2004年
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人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及转移机制的探讨

田波  
【摘要】:肝癌在我国是位列第二位的癌症“杀手”,占我国全部恶性肿瘤死亡人数的 18.8%,占全世界肝癌死亡人数的 53%。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研 究方面均取得了长足的进步,但总体而言,肝癌的预后并没有得到显著的改善, 5 年生存率仍仅有 5%左右。术后复发转移是阻碍生存率进一步提高的最大的障 碍。即使是根治性切除,术后 5 年内,仍有 60%~70%的患者出现转移复发,而 淋巴道转移也是肝癌最常见的转移表型之一。针对肝癌术后转移复发的研究是 21 世纪肝癌研究重点。 肝癌的动物模型和细胞模型是肿瘤转移研究的重要基础和平台,现已建成了 许多稳定的应用广泛的肝癌动物模型和细胞系,但绝大多数动物模型不发生转 移,其中有明确的淋巴道转移潜能的人肝癌动物或细胞模型尚未见报道。肿瘤的 转移是一个高度有序的、非随机的、器官特异性的过程,宿主微环境积极地参与 了肿瘤细胞转移的全过程。目前,器官特异性转移的研究是肿瘤研究的热点之一, 但其具体机制仍然不清楚。近来研究表明,趋化因子及其受体在肿瘤细胞迁移、 侵袭和转移过程中有着重要的作用,发现了一些与特定肿瘤的器官特异性转移相 关的趋化因子及其受体,为转移的防治提供了新的靶点和策略。但趋化因子及其 受体在肝癌转移中的研究尚未见报道。 本课题应用连续体内筛选的方法,建立高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系 HCCLYM,进而通过有限稀释法进行单克隆化,筛选高、低淋巴道转移潜能的 单克隆细胞株 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L,并对其转移特性和基本生物学性状进 行鉴定。具有人肝癌淋巴道转移模型体系的建立,为肝癌的淋巴道转移研究建立 适宜的研究平台,也进一步丰富和完善本所的肝癌转移模型系统。应用分类基因 芯片研究趋化因子及其受体在肝癌器官特异性淋巴道转移中的作用,寻找与肝癌 的淋巴道器官特异性转移相关的趋化因子及其受体,并对其作用机制作初步的探 讨。 第 一 部 分 人肝癌淋巴道转移模型体系的建立及鉴定 本部分的研究目的是建立具有高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系,克隆分离 1 WP=5 博士论文 中文摘要 具有不同淋巴道转移潜能的肝癌细胞株,并对其转移特性和基本生物学性状进行 鉴定,为肝癌的淋巴道转移研究建立适宜的研究平台。 应用本所建立的具有多向高转移潜能的人肝癌细胞系 HCCLM6 为细胞母 系,接种于裸鼠的爪垫部位,原代培养扩增转移淋巴结中的肝癌细胞,重新接种 于裸鼠爪垫,连续 8 轮上述筛选,逐步扩增和纯化细胞母系中具有较高的特异性 的淋巴道转移潜能的肿瘤细胞,建成具有高淋巴道转移潜能的人肝癌细胞系 HCCLYM。 HCCLYM 细胞系肝脏原位移植淋巴结转移率为 83%,肺脏转移率为 40%; 体外培养时为典型的多边形上皮样细胞,贴壁生长,接触性生长抑制丧失,细胞 平均直径 38±2 微米,群体倍增时间 31.6 小时,克隆形成率 54±4%,亚三倍体 核型,染色体数目范围 45~68 条,主流染色体数目为 56~60,占 78%,比较常 见的标志性染色体有 i(X)(q10),der(4)t(4;?)(q31;?),Y 染色体缺如,并可见有 同源染色区的标志性染色体;流式细胞检测细胞周期各时相的百分率分别为 G0-G1 期 54.25%,S 期 25.56%,G2-M 期 10.45%,G2/G1 为 2.04;明胶酶 谱法检测表明 HCCLYM 细胞可分泌大量 MMPs,其中以 MMP-2、MMP-9 及其 活性型为主;PCR 法检测细胞基因组中有 HBV DNA 整合。 HCCLYM 细胞系采用有限稀释法单克隆化,得到 32 个单克隆细胞株,经过 2 轮裸鼠体内筛选,挑选淋巴道转移潜能差别最大的两个单克隆,建株,命名为 高、低淋巴道转移潜能人肝癌细胞株 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L。 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 单克隆细胞株肝脏原位移植淋巴结转移率分别 为 100%和 30%,而肺转移率均为 30%。HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞平均 直径分别为 37±4 微米和 38±5 微米;群体倍增时间分别为 30.3 小时和 32.3 小 时;克隆形成率分别为 37±6%和 27±7%。流式细胞分析 HCCLYM-H 细胞株细 胞周期各时相的百分率分别为 G0-G1 期 56.95%,S 期 29.93%,G2-M 期 13.12%,G2/G1 为 2.04。而 HCCLYM-L 细胞株细胞周期各时相的百分率分别 为 G0-G1 期 60.48%,S 期 27.03%,G2-M 期 12.49%,G2/G1 为 2.04。核型 分析结果显示 HCCLYM-H 细胞株染色体数目范围 53~60 条,主流染色体数目为 55~57,占 87%;而 HCCLYM-L 细胞株染色体数目范围 50~58 条,主流染色体 数目为 53~56,占 83%;HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞株均可见标志性染色 体 i(X)(q10),der(4)t(4;?)(q31;?),Y 染色体均缺如,但仅 HCCLYM-H 细胞株中 可见同源染色区。图 1.10 为 HCCLYM-H 和 HCCLYM-L 细胞株的代表核型。。 两株细胞在体外培养时均可分泌基质金属蛋白酶,以MMP-2 、MMP-9及MMP-9 的活性型为主,其中 HCCLYM-H 分泌 MMPs 的能力明显强于 HCCLYM-L。两 克隆细胞株均可同基底膜组分 IV 型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白发生粘附, 2 WP=6 博士论文 中文摘要 其中同 FN 的粘附能力最强,而 HCC
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R735.7

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