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《复旦大学》 2004年
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重组人粒细胞集落刺激因子对局灶性脑缺血保护作用机制的研究

赵延欣  
【摘要】:缺血性脑卒中是引起人类非自然死亡和致残的主要原因之一。骨髓基质细胞移植治疗脑缺血在动物实验研究中已经取得了明显的效果,但它仍然是一种复杂的操作过程,增加了感染的机会,并且有可能错过治疗脑缺血的时间窗。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)作为一种骨髓干细胞的动员剂可动员造血干细胞和骨髓基质细胞进入血循环,在治疗实验性心肌缺血和脑缺血方面效果明显。骨髓基质细胞能够持续分泌纤维结合蛋白和脑源性神经营养因子(BDNF)。本研究拟观察rhG-CSF干预后局灶性脑缺血大鼠神经功能的改变以及脑组织CD34(造血干细胞特异性标记)、纤维结合蛋白、BDNF和Bcl-2表达的变化。本研究采用缺糖、缺氧(OGD)后复糖、复氧的海马脑片模拟脑“缺血再灌注”模型,用纤维结合蛋白直接干预OGD海马脑片,进一步验证rhG-CSF改善神经功能的机制。骨髓基质细胞移植或与其他细胞混合培养会发生细胞融合。为防止细胞融合现象的发生,本研究采用OGD海马脑片与骨髓基质细胞隔离联合培养技术,避免了二者的直接接触,观察骨髓基质细胞向神经组织细胞的分化情况。 第一部分 rhG-CSF对脑缺血周边区CD34、纤维结合蛋白、BDNF 以及Bcl-2表达的影响 制作大鼠大脑中动脉梗塞模型,缺血2小时后再灌注,分干预组和对照组。干预组皮下注射rhG-CSF,10μg/kg.d,连续5天;对照组给予皮下注射等量生理盐水。每组又分为7、14、21天组。进行神经功能缺损评分。采用免疫组织化学方法观察脑组织内CD34(造血干细胞特异性标记)、纤维结合蛋白、BDNF以及Bcl-2的表达。运用免疫荧光双标法,观察脑内抗Brdu+抗纤维结合蛋白、抗神经胶质元纤维酸性蛋白(GFAP)+抗纤维结合蛋白、抗nestin+抗BDNF以及抗Brdu+抗BDNF的免疫荧光双标染色。 结果显示:干预组第7、14、21天的神经功能评分明显低于对照组(P0.05);干预组第7、14、21天脑缺血周边区CD34免疫阳性细胞数分别为25.95±4.30、16.65±2.85、9.32±1.30;对照组为17.42±3.86、10.95±1.80、6.40±1.04;干预组的CD34免疫阳性细胞数明显多于对照组(P0.05)。干预组第7、14天脑缺血周边区纤维结合蛋白免疫阳性细胞数分别为20.90±5.11、17.83±3.45;对照组为14.07±3.23、11.83±4.12;干预组的纤维结合蛋白免疫阳性细胞数明显多于对照 WP=6 组(P0.05)。对照组第21天已无明显纤维结合蛋白免疫阳性细胞,而此时干预组脑缺血周边区仍有少量的纤维结合蛋白免疫阳性细胞。干预组第7、14、21天脑缺血周边区BDNF免疫阳性细胞数分别为25.10±5.70、16.78±3.75、12.13±3.67;对照组为18.20±4.50、11.70±2.93、6.92±2.53;干预组的BDNF免疫阳性细胞数明显多于对照组(P0.05)。干预组第7天Bcl-2免疫阳性细胞数为24.92±3.35;对照组为19.10±2.01;干预组的Bcl-2免疫阳性细胞数明显多于对照组(P0.05)。 此外,干预组第7天脑缺血周边区的血管结构周围观察到呈簇状分布的纤维结合蛋白免疫阳性细胞。干预组第7天和对照组第7天脑缺血周边区均观察到抗Brdu+抗纤维结合蛋白、抗GFAP+抗纤维结合蛋白和抗nestin+抗BDNF免疫双阳性细胞;干预组第7天的缺血周边区观察到抗Brdu+抗BDNF免疫双阳性细胞。 第二部分 纤维结合蛋白对缺糖、缺氧海马脑片的保护作用 本研究第一部分观察到rhG-CSF可增加脑缺血周边区纤维结合蛋白的表达。本部分拟观察直接运用纤维结合蛋白对缺糖、缺氧海马脑片的保护作用。进一步证明rhG-CSF改善神经功能的机制。 分离、解剖新生SD大鼠的海马结构,经切片后培养。取培养9天、生长良好的海马脑片,经缺糖、缺氧30min(OGD)后复糖、复氧,模拟“缺血再灌注”模型。脑片分未干预组和纤维结合蛋白10μg、20μg、30μg干预组。各组分别培养1、3、7天。观察海马脑片的轴突生长情况,用碘化丙啶荧光排斥法检测海马脑片细胞死亡情况,利用免疫组织化学法观察海马脑片Bcl-2的表达情况。透射电镜下观察纤维结合蛋白对海马脑片超微结构的影响。 研究结果显示:纤维结合蛋白可以明显改善OGD海马脑片的轴突再生。 OGD后第7天未干预组、10μg、20μg、30μg干预组海马脑片死亡细胞面积百分率(%)分别为37.83±8.22、30.25±6.73、20.91±5.25、13.00±3.54;统计结果显示30μg组的死亡细胞所占面积明显小于20μg组,后者明显小于10μg组,三者都小于未干预组(P0.05)。 OGD后第7天未干预组、10μg、20μg、30μg干预组海马脑片Bcl-2阳性细胞数分别为3.63±0.85、6.78±1.16、10.53±1.52、14.73±2.77;海马脑片迁出细胞Bcl-2阳性细胞百分率(%)为2.67±1.21、11.00±1.41、18.00±3.34、26.83±6.62。统计结果显示30μg组的海马脑片Bcl-2阳性细胞数和迁出细胞Bcl-2阳性细胞百分率均明显多于20μg组,后者明显多于10μg组,三者都多于未干预组(P0.05)。 此外,实验还观察到纤维结合蛋白可明显减轻OGD海马脑片超微结构的损伤。 WP=7 第三部分: OGD海马脑片对骨髓基质细胞向神经组织细胞分化的影响 本研究第一部分观察到rhG-CSF可动员骨髓干细胞经血循环进入缺血侧的脑组织。本部分将骨髓基质细胞与OGD海马脑片联合培养,两者不直接接触以避免细胞融合。观察骨髓基质细胞向神经组织细胞的分化情况,以间接证明rhG-CSF改善
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