收藏本站
《复旦大学》 2004年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

新型葡激酶突变体的研制、性质及药效学研究

苏华波  
【摘要】:血栓栓塞是多种心血管疾病的主要发病原因之一。目前,已有多种溶栓制 剂如组织型纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶及其突变体等被用于治疗血栓性 疾病,它们能有效降低病人的致死率和致残率。但是,目前的溶栓剂仍存在着 再通不完全、初始再灌注延迟、血栓再形成、出血和过敏反应等缺陷。葡激酶 (Staphylokinase,Sak)具有与组织型纤溶酶原激活剂相当的溶栓活性,并有更 高的纤维蛋白专一性,能以大肠杆菌为宿主大量制备,是一种很有应用前景的 溶栓剂。血小板聚集在血栓形成中起重要作用。血小板聚集依赖于特有的功能 性受体 GPIIb/IIIa。国内外根据 Arg-Gly-Asp 三肽序列已设计了许多 GPIIb/IIIa 受体阻断剂,用于抑制血小板聚集。 为研制兼具溶栓和防栓功能的低免疫原性新型溶栓剂,以降低溶栓后再栓 发生率,根据葡激酶单体、微小纤溶酶?葡激酶?微小纤溶酶三元复合物的晶体 结构,运用计算机辅助分子模拟技术并结合功能信息合理设计了新型的葡激酶 突变体分子,在 Sak 分子的合理位置引入了 RGD 序列。以野生型 Sak 基因为模 板,通过 PCR 获得突变基因,测序证实后与大肠杆菌表达载体 pLY-4 重组并转 化大肠杆菌 JF1125 获得工程菌。纯化工程菌表达的突变体蛋白并检测其纤溶活 性、酶动力学常数、抑制血小板聚集活性和免疫原性,结果显示,突变体 DGR 和 RL1 具有与野生型 Sak 相当的纤溶活性,能显著抑制血小板的聚集,且免疫 原性显著降低。 在已获得的新型重组葡激酶突变体 DGR 高效表达菌的基础上,初步建立了 快速、简便、高效的中试工艺。采用低密度发酵,每升培液可收获湿菌 8 g,表 达水平在 60%以上。菌体破胞后经超滤浓缩,凝胶过滤和离子交换层析二步纯 化即可获得纯度为 97%以上,比活性 11.5×104 HU/mg 的 r-DGR 半成品,产率 达 290 mg/L 培液。DGR 分子量为 15,455,等电点为 pH 6.6。 应用兔股动脉血栓模型,进行 DGR 的药效学研究,以评价 DGR 在体内的 溶栓、防栓、抗血小板聚集作用及对血液凝血纤溶功能的影响,并与野生型 Sak 比较。新西兰白兔 21 只,在远端狭窄和内皮损伤的股动脉注入凝血酶诱导血栓 形成,分生理盐水组(n=3)、r-Sak 组(0.3 mg/kg,n=6)、DGR 低剂量组(0.15 mg/kg,n=6)和 DGR 高剂量组(0.3 mg/kg,n=6)给药。全药量分 4 次经耳 缘静脉推注,每次间隔 10min。给药后连续观察股动脉血流量 2 h,于给药前, 1 WP=5 博士论文 摘要 给药后 60min,120min 采血测定血小板聚集率及凝血和纤溶指标。结果显示, 0.15 mg/kg 的 DGR 与 0.3mg/kg 的 r-Sak 的溶栓效率相当,0.3mg/kg 的 DGR 取 得初次再通时间较 r-Sak 缩短了一半,同时总开放时间延长。r-Sak 组再栓发生 率为 50%(3/6),而 DGR 高低剂量组均未见再栓(0/6)。给药后 60min 和 120min, DGR 高剂量组血小板聚集率分别下降了 30%和 20%,DGR 低剂量组下降了 21% 和 14%, 而生理盐水组和 r-Sak 组无显著变化。给药后各组的 TT、PT、aPTT 和 Fg 均无显著变化。以上结果提示 DGR 能快速高效溶栓和抑制血小板聚集, 有一定的防栓作用,而且不影响系统的凝血功能。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R96;R943

手机知网App
【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 贺进田;王改珍;狄静芳;徐瑞光;宋后燕;;重组葡激酶突变体K35R纯化过程中宿主菌菌体蛋白残余量的免疫分析[J];河北师范大学学报;2006年06期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 贺进田;双功能葡激酶突变体(RGD-Sak,DGR)的中试研究及其PLGA缓释微球的研制[D];复旦大学;2005年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 于敏,张小璇,任军,蔡旭,孙翠娥,朱运松,宋后燕;注射用重组葡激酶的中试研究[J];高技术通讯;1998年01期
2 汤其群,张小璇,于敏,宋后燕;重组葡激酶(r-Sak)的分离、纯化和结晶[J];药物生物技术;1997年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 黄义德,潘艳虹,赵蓉,朱苏闽;重组葡激酶(r-Sak)工程菌发酵工艺的研究[J];福建师范大学学报(自然科学版);2001年03期
2 宋钢,于敏,莫炜,宋后燕;一种新型葡激酶分子的设计基因构建表达纯化及性质研究[J];中国工程科学;2000年11期
3 翟中金;葡激酶的研究进展[J];国外医学(临床生物化学与检验学分册);1998年04期
4 王改珍;苗凤智;刘英华;孙亚红;贺进田;;葡激酶蛋白质工程研究进展[J];河北工业科技;2007年05期
5 王蔚青,邵志高,刘广余,张静,张宏文,李春坚;人血浆中重组葡激酶的生物法含量测定及药动学[J];中国临床药学杂志;2004年03期
6 ;Construction and Characterization of Novel Staphylokinase Variants with Antiplatelet Aggregation Activity and Reduced Immunogenecity[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年05期
7 叶立文,宋钢,宋后燕;重组葡激酶N端缺失突变体对纤溶酶原的激活作用[J];上海医科大学学报;2000年01期
8 宋钢,莫炜,宋后燕;低免疫原性的新型葡激酶ΔNMSak在大肠杆菌中的高效表达和分离纯化[J];中国生物化学与分子生物学报;2000年06期
9 李倩,荫俊,付玲,李广善,宋伟,李成文,徐秀芝;重组葡激酶的分离纯化[J];生物技术通讯;2000年01期
10 李春坚;葡激酶的研究进展[J];心血管病学进展;2002年02期
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 于永生;人尿激酶原突变体的构建与特性分析[D];西北农林科技大学;2005年
2 张宇杲;葡激酶模拟肽的研究[D];复旦大学;2004年
3 贺进田;双功能葡激酶突变体(RGD-Sak,DGR)的中试研究及其PLGA缓释微球的研制[D];复旦大学;2005年
4 陈宏山;新型重组双功能葡激酶(RGD-SAK)的中试和临床前研究[D];复旦大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 刘健;SAK基因真核载体的构建及其转基因细胞表达的研究[D];南京农业大学;2006年
2 狄静芳;N-端引入RGD序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究[D];河北师范大学;2008年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 孙汉栋,周黎,陈亚红;聚乙二醇修饰蛋白药物研究进展[J];儿科药学杂志;2004年04期
2 于敏,张小璇,任军,蔡旭,孙翠娥,朱运松,宋后燕;注射用重组葡激酶的中试研究[J];高技术通讯;1998年01期
3 徐静;聚乙二醇修饰蛋白质类药物的研究现状及展望[J];国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册);2004年02期
4 童明庆,戴传箴,蒋理,赵旺胜;重组葡激酶的人体药代动力学研究[J];南京医科大学学报;2000年02期
5 陆凤翔,黄元铸,陈椿,盛瑞兰,张银娣,许迪,盛燕辉,陆化,徐卫,张建富;注射用冻干重组葡激酶Ⅰ期临床耐受性研究[J];南京医科大学学报;2000年04期
6 ;Construction and Characterization of Novel Staphylokinase Variants with Antiplatelet Aggregation Activity and Reduced Immunogenecity[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年05期
7 邱丽娟;生化药物生产过程中控制热原的方法[J];中国生物工程杂志;2002年03期
8 陈昕;下游层析工艺中热原的去除[J];中国生物工程杂志;2002年04期
9 宋钢,莫炜,宋后燕;低免疫原性的新型葡激酶ΔNMSak在大肠杆菌中的高效表达和分离纯化[J];中国生物化学与分子生物学报;2000年06期
10 张艳,陈培榕,周海梦;用FTIR研究SDS对肌酸激酶二级结构的影响[J];生物物理学报;1994年02期
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 薛宇醒;范咏;徐小晓;华隽伟;潘伟忠;韦利军;;应用ELISA法检测门冬酰胺酶中残余大肠杆菌菌体蛋白含量的研究[J];药物生物技术;2012年03期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴纬;葡激酶及其研究进展[J];国外医学.输血及血液学分册;1999年02期
2 马端;特异性溶栓剂:葡激酶[J];国外医学.心血管疾病分册;1998年04期
3 于爱平;张传领;董春娜;于红阳;钟根深;王立生;吴祖泽;;重组葡激酶和水蛭素融合蛋白的血栓靶向性机制(英文)[J];生物工程学报;2008年11期
4 李伯刚,吴洽庆,柴斌威;葡激酶的研究进展[J];天然产物研究与开发;1997年02期
5 郭为民;葡激酶的临床应用研究进展[J];国外医学.输血及血液学分册;1999年04期
6 包承鑫;全国抗栓溶栓学术会议纪要[J];中华医学杂志;1996年05期
7 钟倩;葡激酶治疗急性心肌梗死有效[J];国外医药.合成药.生化药.制剂分册;1998年04期
8 孟德鸣,庄燕黎,缪新伟;抗葡激酶单克隆抗体的制备与鉴定[J];临床检验杂志;2001年01期
9 ;第二次全国抗栓溶栓学术研讨会征文通知[J];中华内科杂志;2002年10期
10 李春坚;葡激酶的研究进展[J];心血管病学进展;2002年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 俞梅敏;焦建伟;茹炳根;;一种同时兼有溶栓—抗栓功能分子的研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
2 韩金祥;王健;;重组变异葡激酶的表达、纯化和鉴定[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
3 苏旭;李滨;陈福真;;急性下肢深静脉血栓形成205例的综合治疗[A];《中华急诊医学杂志》第八届组稿会暨急诊医学首届青年论坛论文汇编[C];2009年
4 王进华;王小平;郝美金;薛军强;;彩色超声心动图对急性心肌梗塞溶栓治疗前后心功能变化的研究[A];庆祝中国超声医学工程学会成立20周年——第八届全国超声医学学术会议论文汇编[C];2004年
5 魏洁;赵莘瑜;;经颅多普勒超声对脑梗死患者溶栓治疗前后的检测及其临床意义[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
6 潘仁龙;;自发性脑室内出血应用重组链激酶灌注治疗[A];中国医师协会神经外科医师分会首届全国代表大会论文汇编[C];2005年
7 李斌;廖旺;王卫;王圣;王青;黄雪汝;王瑜;赵军;;未达溶栓标准的急性ST段抬高心肌梗死冠状动脉造影特点[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
8 潘宁;李丹;杨欣;黄雪兰;王薇;卢晓潇;;彩色多普勒超声诊断下肢静脉血栓及溶栓后效果的应用[A];中华医学会第十次全国超声医学学术会议论文汇编[C];2009年
9 闫福岭;方树友;许予明;;尿激酶不同途径给药治疗超早期脑缺血的多中心临床研究[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
10 刘林红;王冬梅;董丽君;姜兴余;;门冬氨酸钾镁极化液在急性心肌梗死溶栓治疗中的作用[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李闽春;溶栓治疗——葡激酶独领风骚[N];医药经济报;2002年
2 李斌;从蚯蚓中可分离出抗栓溶栓物质[N];中国医药报;2001年
3 陈列欢;溶栓有了新“钻头”[N];医药经济报;2004年
4 于濛;快速交通能否“溶栓”[N];中国财经报;2005年
5 勇;ACS的标准治疗是抗栓[N];医药经济报;2003年
6 秋;比利时用新型激酶溶栓[N];中国高新技术产业导报;2001年
7 任儒倬 董长林 吴延华;瑞通立获两项国家级殊荣[N];国际商报;2010年
8 吴延华;瑞通立被列为国家火炬计划项目及国家级重点新产品[N];中国贸易报;2008年
9 上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏科 施仲伟 教授;抗栓研究绽放ESC 2009[N];医药经济报;2009年
10 许锦东;急性心梗溶栓成败的关键———时间[N];中国医药报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 苏华波;新型葡激酶突变体的研制、性质及药效学研究[D];复旦大学;2004年
2 石炳兴;靶向溶栓抗凝双功能融合蛋白的构建表达及在血栓疾病治疗中的应用研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
3 于爱平;溶栓抗凝双功能融合蛋白的构建表达和功能研究及PEG修饰的水蛭素缓释剂型的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
4 张东方;参环毛蚓中抗栓活性蛋白酶的研究[D];辽宁中医学院;2004年
5 齐海萍;豆豉纤溶酶的制备、酶学特性及功能性质研究[D];江南大学;2004年
6 倪健;抗栓素药学及药代动力学研究[D];北京中医药大学;2004年
7 陈炫;葡激酶体外定向进化的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
8 张宇杲;葡激酶模拟肽的研究[D];复旦大学;2004年
9 陈宏山;新型重组双功能葡激酶(RGD-SAK)的中试和临床前研究[D];复旦大学;2007年
10 兰文军;富含黄酮的山楂叶抽提物调控内皮细胞损伤及其抗栓功能的研究[D];浙江大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘玉英;重组水蛭素-葡激酶融合蛋白、长效水蛭素的药效学研究和水蛭素拮抗药的发现[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
2 杨可;重组葡激酶的表达纯化及其纤溶活性的鉴定[D];重庆医科大学;2012年
3 朱贺;葡激酶及其衍生体对非酒精性脂肪肝病治疗作用的研究[D];河北大学;2009年
4 狄静芳;N-端引入RGD序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究[D];河北师范大学;2008年
5 孙家安;r-SAK和r-tPA治疗急性心肌梗死的疗效和安全性的随机对照研究[D];河北医科大学;2005年
6 璩竹玲;海洋假单胞菌碱性蛋白酶的抗栓作用研究[D];青岛大学;2002年
7 黄贤胜;重组葡激酶和直接冠状动脉介入术治疗急性心肌梗死临床疗效比较[D];吉林大学;2005年
8 王旻;低免疫原性葡激酶的构建及功能分析[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
9 刘义德;120-CCU溶栓模式治疗急性心肌梗死137例临床分析[D];中国医科大学;2004年
10 李慧;葡萄再生体系的建立及葡激酶基因(sak)植物表达载体的构建[D];北京林业大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026