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《复旦大学》 2004年
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树突状细胞瘤苗治疗大鼠颅内胶质瘤的实验研究

朱新梅  
【摘要】:目的:探索树突状细胞(Dendritic Cell, DC)瘤苗在脑胶质瘤治疗中的意义,为脑胶质瘤的治疗提供一种新的思路和手段。 建立稳定及可靠的大鼠C6胶质瘤模型,了解其免疫状态; 制备及筛选高效瘤苗; 进行有效地瘤苗体内治疗。 方法: 建立大鼠C6脑胶质瘤种植模型:首先体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,然后收集处于对数生长期的C6胶质瘤细胞,经PBS洗涤后悬浮于含10g/L琼脂糖无血清培养基中,5×105C6细胞悬液10ul立体定向注入大鼠右脑尾状核;接种后行一般临床观察、MRI检查,并对接种大鼠分别在第7、14、21、28、35天、及自然死亡之前做主动脉多聚甲醛灌注固定,对脑组织和肿瘤标本进行切片观察和HE染色及GFAP免疫组化染色,并通过流式细胞仪检测荷瘤大鼠外周血CD8+T淋巴细胞水平。 DC瘤苗的制备与选取:自大鼠骨髓分离DC前体细胞,经重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)+ 白细胞介素4(rrIL-4)诱导培养、扩增;由C6胶质瘤细胞经由反复冻融、超声破碎细胞抽提其总蛋白及热诱导C6细胞凋亡的方法制备各种不同抗原致敏DC,致敏的DC与T淋巴细胞进行共培养诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL);以ELISA法检测CTL诱导过程中淋巴细胞趋化因子(lymphocyte chemoattractant factor)及细胞因子IFN-γ分泌水平;以3H-TdR掺入法检测DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL杀伤活性。 DC瘤苗体内治疗研究:将经凋亡C6胶质瘤细胞体外致敏的DC瘤苗皮下回输荷瘤大鼠体内,1次/周,共5次。观察荷瘤大鼠的存活期;以流式细胞仪检测循环血中CD8+T淋巴细胞水平、体外细胞毒反应及循环血中淋巴细胞的 WP=6 增殖反应;ELISA法检测血清中IL-10及IFN-γ水平;以观察凋亡C6胶质瘤细胞致敏的树突状细胞瘤苗对颅内胶质瘤免疫治疗的效果及安全性。 结果: 本研究应用立体定向尾状核接种C6胶质瘤细胞,所有接种大鼠均有胶质瘤生长(100%),免疫组化GFAP染色阳性,证实肿瘤是胶质细胞来源;肿瘤生长速度于第三周开始明显加快;荷瘤大鼠外周血中CD8+T淋巴细胞随着肿瘤生存时间的延长明显降低(21.93±3.81%),与正常大鼠(27.92±1.30%)相比P=0.004,差异显著。 体外研究显示我们的培养体系培养出的DC具有典型DC的“树枝状突起”的形态特征,细胞表面高表达CD11c、OX6(MHCI)、OX62、MHCII类分子等大鼠DC相对特异的表面分子,相对低表达协同刺激分子CD80、CD86,表型特征为非充分成熟的树突状细胞,满足制备肿瘤疫苗的需要;而且观察到以不同抗原处理方式制备的抗原致敏DC得到的肿瘤疫苗中,其中以凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗有更强的刺激T细胞增殖的能力,另外在诱导CTL过程中分泌的淋巴细胞趋化因子以及细胞因子IFN-γ也明显高于其它组、并且可以诱导杀伤活性更强的CTL。 经凋亡C6胶质瘤细胞致敏的树突状细胞免疫治疗组的荷瘤大鼠生存期明显延长,与对照组相比P=0.0026;治疗组外周血中CD8+T淋巴细胞比例显著高于PBS对照组,P=0.004,与未致敏DC组比较P=0.037,PBS组与未致敏DC组比较P=0.75;CTL分析结果显示治疗组可以诱导针对胶质瘤细胞的杀伤性免疫应答;并且治疗组大鼠循环血中IFN-γ水平明显升高,而IL-10水平很低,甚至检测不到。 结论: 立体定向尾状核接种C6胶质瘤细胞制备大鼠胶质瘤模型的方法,接种成功率高达100%。 与其它方方式制备的抗原相比,以凋亡的肿瘤细胞作为抗原负载DC获得瘤苗可获得更强的抗肿瘤保护作用。 WP=7 经凋亡C6胶质瘤细胞致敏的DC瘤苗对颅内胶质瘤进行免疫治疗能获得安全有效的治疗性保护作用。 本研究创新之处: 本研究结合以往研究经验建立大鼠C6脑胶质瘤模型的同时首次对C6胶质瘤荷瘤机体的免疫状态进行了研究和观察; 本研究应用了多种不同方式制备针对胶质瘤的肿瘤抗原致敏DC制备肿瘤疫苗,并对其有效性做了观察比较,这在胶质瘤的免疫治疗研究中尚属首次; 本研究经过比较筛选采用了凋亡胶质瘤细胞致敏DC获得肿瘤疫苗进行体内主动免疫治疗;该研究中应用多项指标进行严格监测,比以往该领域的研究都更全面、具体、深入细致。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R739.4

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