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《复旦大学》 2004年
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神经突触前膜胞内蛋白(Munc18)抗体慢性点燃致痫大鼠及其致痫机制的研究

陈功  
【摘要】:自从在儿童癫痫症--RE脑炎患者体内先后检测出了GluR3抗体(1994年)和Munc18抗体(2000年),并发现抗体的滴度与患者癫痫的发作相关以来,国外陆续有GluR3抗体方面的报道,但均未见有关Munc18抗体方面的报道,其致痫机制更未涉及。为了研究Munc18抗体的作用以及其可能致痫机制,我们在SD大鼠进行了体内、体外和整体实验,并结合临床标本来论证动物实验的结果;同时,以GluR3抗体作为阳性对照加以类比和分析。 第一部分(体外实验):Munc18抗体和GluR3抗体诱导海马神经细胞细胞毒性和凋亡的研究 取SD新生鼠海马皮层组织,以此培养的原代神经细胞作为靶细胞。抗体在不同的作用时间(20 h和40 h)和4个梯度稀释倍数下,通过细胞存活率(MTT法)和LDH释放量(LDH释放法)来测定抗体对神经细胞的毒性;TUNEL染色法来测定神经细胞的凋亡及其指数(AI)。共分为4组:A组加Munc18抗体,B组加GluR3抗体,C组混合加入Munc18和GluR3抗体(G+M)以及对照组。 结果:Munc18抗体和GluR3抗体对神经细胞都具有细胞毒性和凋亡作用(P<0.05或P<0.01);并与抗体的滴度和作用时间呈依赖性。在细胞毒性方面:GluR3抗体的作用强于Munc18抗体(P<0.05);在细胞凋亡方面:与细胞毒性相反,Munc18抗体的作用明显强于GluR3抗体(P<0.05)。G+M的作用与单独使用其中一种抗体相似,未观察到二种抗体的叠加或放大作用。 第二部分(整体实验):Munc18抗体慢性点燃大鼠癫痫模型的建立 选用8周龄SD大鼠在海马CA1区置管。模型制作成功4d后,经置管注射抗体。每次1μl,隔天注射1次共5次,之后改为每隔二周注射1次共4次。监测和观察注射前后的脑电图(EEG)和痫样行为。共分为6组:实验A组注射Munc18抗体,实验B组注射GluR3抗体;对照C组注射盐水,对照D组仅置管但不注射,对照E组为假手术组,以及正常F组。 结果:Munc18抗体能慢性点燃致痫大鼠。83%的大鼠有痫样脑波,75%的大鼠有痫样行为。多数是在3~5次注射后发作,以2~4级行为多见,5级少见; 复旦大学博士论文中文摘要 3级以上行为的大鼠有5只,成功率为42%(5八2)。在8周后,在已有痈样脑 波和痈样行为的大鼠中,各有50%和44%的大鼠仍保留有其相应的痈样脑波和 行为。未观察到注射GtuR3抗体组和对照组大鼠有明显的痈样脑电或痈样行为。 第三部分(体内实验):Munc18抗体诱导大鼠海马区神经元凋亡、c·FOS蛋白 和c一JUN蛋白表达的研究 模型建立、注射方法和分组如前。分批宰杀取脑以利于动态观察和研究; HE、Nissl和TUNEL染色以观察神经元的变性、凋亡和坏死;细胞计数以测定 神经细胞的丢失情况;整个海马区的凋亡指数(Af)来研究抗体对海马的作用影 响:c一FOS蛋白和c一JUN蛋白免疫组化来反应抗体对神经细胞的损伤刺激程度和 范围。 结果:Muncls抗体除在局部穿刺区域造成神经元损伤外,还可诱导整个海 马区域神经细胞的变性和凋亡,如:齿状回区、CAZ区和CA3区;同时,它还 可诱导海马区神经细胞数量的减少,以及c-FOS蛋白和c一川N蛋白的强烈表达; 另外,还观察到它能诱导神经损伤沿脐肌体向对侧皮层和海马传播扩散。GkiR3 抗体可造成局部海马穿刺区较严重的损伤,如:神经元变性和坏死,伴胶质细胞 的大量增生;但它对海马非损伤区域的影响作用较小。 第四部分(临床实验):难治性颖叶癫病患者的海马和颖叶皮层的病理学、c-FOS 蛋白、c一JUN蛋白表达的研究 收集难治性颗叶癫痈(TLE)患者海马和颗叶皮层标本各14例,其脑片分别 做Nissl、TUNEL染色以及c一fos、c一JUN免疫组化。对照组为无癫痈症状的颗叶良 性肿瘤旁的颗叶皮层(10例)。 结果:TLE患者海马和颖叶区的神经元形态异常,其数量有减少;伴有胶质 细胞的增生,同时有较多的凋亡细胞;c一FOS蛋白和c一JUN蛋白有大量表达。上 述病理学的变化与Muncls抗体致痈大鼠海马区所观察到的病理改变相同。 结论:建立了Muncls抗脑抗体慢性点燃大鼠癫痈动物模型。Muncls抗体 的致痈机制与其能诱导整个海马区域神经细胞的变性、凋亡和丢失以及诱导神经 元损伤沿脐服体向对侧皮层和海马传播扩散有关。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R742.1

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【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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