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《复旦大学》 2004年
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L-[1-~(13)C]苯丙氨酸呼气试验检测肝功能生物学机制及临床应用研究

严惟力  
【摘要】:13CO2呼气试验检测肝功能具有使用安全、操作简便、非侵害性、即时性、整体性和特异、定量的特点,被用于包括肝细胞微粒体、线粒体和胞浆等在内的多种肝细胞器功能的检测。由于多种呼气试验底物的药源性,底物代谢相关酶可能被其他药物诱导,以及试验的生物学机制多不明确等原因,所以各类呼气试验仍处于研究探索阶段。L-[1-13C]苯丙氨酸呼气试验(PheBT)是近年来多位研究者报道的定量肝功能检测试验。临床资料显示,在不同的受试群体中PheBT对肝病诊断具有相当的应用价值。 目的: 为基础实验提供有效的动物呼气试验模型;研究急性CCl4肝损伤大鼠肝脏苯丙氨酸羟化酶活性与PheBT参数的相关性;研究肝硬化大鼠肝脏内苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性以及PAH和TYT基因转录水平与PheBT参数的关系; 研究大鼠肝组织PAH蛋白的表达和分布; 从而揭示PheBT定量检测肝功能的生物学机制,探讨试验参数反映大鼠肝脏功能和肝细胞损害的可行性和有效性;验证PheBT对临床乙型肝炎后肝硬化分级的诊断价值;优化临床PheBT方法学,寻找灵敏而全面地反映肝脏功能的试验参数。 方法: 灌胃给予CCl4复制大鼠急性肝损伤模型,采用改进后的小动物机械通气装置,结合静脉给予L-[1-13C]苯丙氨酸(13C-phe)及间断气样采集进行大鼠PheBT,应用13C排除速率常数PheBT-k评价大鼠体内苯丙氨酸氧化能力和肝功能损害。 采用酶偶联法检测肝脏PAH活性,研究急、慢性肝损伤大鼠肝脏PAH活性的变化与PheBT参数的相关性。 背部皮下注射CCl4复制大鼠慢性肝硬化模型,静脉给予13C-phe进行PheBT, WP=5 并采用试验参数PheBT-k和单位质量肝组织PheBT-k (PheBT-k/LW) 评价肝硬化大鼠功能储备和肝细胞损害。 肝脏组织切片进行常规HE染色和Van Gieson胶原染色,采用人工半定量计分和细胞图像定量分析对肝细胞损害和肝脏纤维化程度进行评定。 采用实时荧光定量PCR的Taq Man技术检测肝脏PAH基因和酪氨酸转氨酶(TYT)基因转录水平,研究呼气试验参数PheBT-k/LW与苯丙氨酸代谢相关酶mRNA表达的相关性。 采用免疫组织化学法对肝脏PAH蛋白的表达进行检测,研究大鼠肝脏PAH蛋白的分布规律以及肝硬化大鼠肝脏PAH蛋白表达的改变。 临床自愿者口服PheBT采用三种不同13C-phe给予剂量50mg、100mg和150mg;试验前禁食时间分别为0.5h、2h、4h、7h和12h;年龄者年龄分为大于40岁和小于40岁两组,受试者均为健康成年人。 每位临床受试者给予100mg 13C-phe,禁食12h,研究多项试验参数在健康受试者和各级肝硬化患者间的差异,以及试验参数与临床生化指标和Child-Pugh计分的相关性。 结果: CCl4急性肝损伤大鼠全肝PAH总活度和呼气试验参数PheBT-k均显著低于正常大鼠; 且大鼠全肝PAH总活度与Phe-k高度正相关(r=0.92, P 0.001);肝损伤大鼠PheBT-k与多项血液肝功能指标相关; 肝硬化大鼠呼气试验参数PheBT-k与全肝PAH总活度高度正相关(r=0.85, P0.001);单位质量肝脏组织中PAH活度和PheBT-k显著下降;试验参数PheBT-k/LW与单位质量肝组织中PAH活度高度正相关(r=0.94, P0.001); 肝硬化大鼠试验参数PheBT-k/LW与肝湿重(r=-0.51,P0.05)、肝脏纤维化计分(r=-0.57,P0.01)和胶原面积百分比(r=-0.52,P0.05)呈负相关,与部分血液学指标相关; 肝硬化大鼠肝脏PAH mRNA表达显著下调;肝脏组织PAH基因转录水平与PheBT/LW显著相关(r=0.81,P0.001和r=-0.55,P0.01); 正常和肝硬化大鼠肝脏TYT mRNA表达没有显著性差异,且TYT基因转录水平与PheBT参数没有显著的相关性; 肝脏PAH蛋白免疫组化染色结果显示,正常大鼠PAH在肝脏组织中表达分布基本均匀;肝硬化大鼠肝组织中PAH蛋白表达下调,且分布不均,呈大片状和/或团块状分布; 临床口服PheBT参数在不同性别和年龄健康受检者中差异无显著性;试验前 WP=6 至少禁食7h,100mg/人13C-phe即可满足试验要求; PheBT参数13CERmax、13CER30、T1/2、13Ccum60、13Ccum75和13Ccum90在健康受试者和Child-Pugh各级间差异显著,且与血清白蛋白、总蛋白、总胆红素和凝血酶原活动度等肝功能血液生化指标和临床Child-Pugh计分相关。 结论 小动物机械通气装置结合间断气样采集法是一种安全、有效的动物实验方法,可用于基础和临床呼气试验研究领域; 急性CCl4肝损伤大鼠PheBT参数PheBT-k的改变是苯丙氨酸代谢限速酶-苯丙羟化酶活性改变的直接结果;PheBT-k能够反映大鼠急性肝功能损害的严重程度; 肝硬化大鼠肝脏PAH总活度降低是PheBT-k下降最直接的原因;PheBT-k能够定量反映肝硬化大鼠肝功能储备;PheBT-k/LW能够定量反映肝硬化大鼠肝脏的损伤程度; 试验参数PheBT-k/LW能够定量反映肝硬化大鼠肝组织中PAH基因转录水平和PAH蛋白的表达。 TYT对PheBT结果可能不会产生决定性的影响; 临床口服PheBT呼气试验是一项安全、简便、灵敏、无侵害性的定量肝功能试验,可用于判断乙型肝炎后肝硬化的存在和严重程度,它对临床Child-Pugh分级和肝脏组织病理检查起到补充作用。综合评判试验参数13CER30、T1/2与13Ccum60等指标能全面有效地评价肝脏功能储备和肝脏细胞损害严重程度。
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