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《复旦大学》 2004年
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黄芪多糖对NOD小鼠1型糖尿病的预防作用及其机理研究

陈蔚  
【摘要】:目的: 1 型糖尿病是在多基因遗传基础上由环境因素触发的自身免疫性疾病。 其发病时往往90%以上的胰岛β细胞已遭破坏,患者须终身应用胰岛素治疗, 如剂量不当易发生低血糖或酮症酸中毒,其心、脑、肾慢性并发症也给病人 带来极大的痛苦,甚而威胁生命。因此,选择药物对 1 型糖尿病进行免疫干 预并深入探讨其作用机理具有重要的理论意义和临床实用价值。 1 型糖尿病的发生与自身免疫调节失衡密切相关。当机体对胰岛多种抗 原成分失去耐受后,主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类分子与其处理的β细 胞抗原共同激活辅助性 T 淋巴细胞(Th)中的 Th1 亚群,抑制 Th2 亚群,造 成 Th1/Th2 型细胞因子的不平衡;进而激活细胞毒性 T 细胞(TCL)、巨噬细 胞(MΦ)、自然杀伤细胞(NK),从而产生氧自由基、一氧化氮(NO)、细胞 因子(IL-1、TNFα/β、IFN-γ)等,对胰岛β细胞产生直接毒性,导致自 身免疫性胰岛炎的发生。 大量研究表明,CD4 辅助性 T 淋巴细胞为 1 型糖尿病的主要免疫介导细 + 胞。正常情况下,CD4 Th 细胞处于前体状态,为仅表达少量 IL-2 的 Thp 细 + 胞;当特异性抗原刺激抗原提呈细胞后,Thp 细胞被诱导为 Thp 细胞,后者 + 迅速分化为 Th0 细胞;Th0 细胞为 Th1 或 Th2 细胞的前体细胞,在 INF-γ的 刺激下可分化为 Th1 细胞,在 IL-4 的刺激下,则可分化为 Th2 细胞。Th1 细 胞主要分泌 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、INF-γ 等细胞因子,介 导细胞免疫应答,有促进 Th0 细胞分化成熟的功能,又有抑制 Th2 细胞的功 能。Th2 细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β 等细胞因子,介导体液 免疫,有抑制 Th1 细胞的功能。两类细胞通过自身或其它免疫细胞分泌的细 胞因子进行交叉调节、相互抑制,维持着机体的自身免疫平衡。 研究表明,Th1 细胞及其细胞因子对 1 型糖尿病有促进作用,而 Th2 型 细胞/细胞因子则对胰岛β细胞起保护作用。1 型糖尿病的发生与 Th1 亚群过 度活化及 Th2 亚群相应抑制所导致的免疫失平衡状态密切相关。近年来,国 内外学者尝试在1型糖尿病的发病前期应用免疫干预以阻止胰岛的自身免疫 反应,并已成为当今研究的一大热点。 目前常用的 1 型糖尿病免疫干预制剂有以下几类:① 促进免疫反应由 Th1 型向 Th2 型转化,如谷氨酸脱羧酶、热休克蛋白、弗氏佐剂、卡介苗、 双羟维生素 D3、胰岛素样生长因子-1、抗白介素-12 抗体、磷酸二酯酶抑制 1 WP=5 剂等;② 抑制 T 细胞对抗原的识别,如抗 CD3 抗体,抗 CD4 抗体等;③ 抑 制胰岛细胞凋亡,如尼克酰胺,FasL,低剂量γ-射线辐照等;④ 基因免疫 治疗,即将有免疫保护作用的基因(如 IL-4,IL-10,IL-12)导入到胰岛表 达。近年来,中草药的降糖作用已越来越引起人们的重视,其可能的降糖成 分包括多糖、生物碱、黄酮、皂甙等类型,多糖为其中比重最大的一类。黄 芪多糖(Astragalus Polysaccharide,简称 APS)是黄芪提取液中的均一多 糖部分,为黄芪主要的活性成分之一,由 APSⅠ、Ⅱ组成。APSⅠ是杂多糖, 由 D-葡萄糖、D-半乳糖和 L-阿拉伯糖组成;APSⅡ为葡聚糖,由α-(1→4) -D-糖苷键连接而成。已有研究表明,APS 是一种有效的免疫调节剂,对机体 细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫及细胞因子的活性均有调节作用;本课 题的前期研究发现,APS 能降低 STZ 糖尿病大鼠的血糖水平,对糖尿病心肌 病变、肾脏病变均有保护作用;然而 APS 对 1 型糖尿病的预防作用及其可能 机制的研究在国内外尚无报道。本课题深入研究 APS 对 NOD 小鼠 1 型糖尿病 的预防作用,并探讨其对 NOD 小鼠 Th1/Th2 型细胞/细胞因子免疫失衡的重建 作用,从而为黄芪多糖用于预防 1 型糖尿病提供实验基础和理论依据。APS 因其天然性、低毒性、来源广泛、造价低、制备方便,如能成为 1 型糖尿病 的免疫干预制剂,将具有较大的社会意义和经济价值。 方法:1. 选取体重 10g~15g 的 4 周龄雌性 NOD 小鼠 40 只,随机分为两组:黄芪 多糖预处理组(APS 组)20 只,生理盐水对照组(NS 组)20 只; 4 周 龄起给予 APS 组 APS 2.0 g/kg/d p.o.×10 周,给予 NS 组等量的生理 盐水;40 周龄时处死小鼠,留取血清、胰腺、脾脏标本。 2. 运用生化、RIA、ELISA 方法检测血糖、血清 C-肽和 GAD-Ab 水平。 3. 光镜下观察胰岛的组织病理,进行胰岛炎分级计数。 4. 电镜下观察胰岛β细胞的超微结构。 5. 运用免疫组织化学法分析胰岛浸润 T 淋巴细胞的 CD4 、CD8 亚群。 + + 6. 运用流式细胞仪分析脾组织 T 淋巴细胞 CD4 /CD8 亚群比值。 + + 7. 抽提两组小鼠每个胰腺的总 RNA,作纯度鉴定。 8. 抽取 APS 组每个胰腺样本 10μg 总 RNA,等量混合,作为 APS 组胰腺总 RNA 样本,同法获取对照组胰腺总 RNA 样本;运用基因芯片技术对两组 总 RNA 样本进行检测,用专业软件分析检测结果。 9. 运用 RT-PCR 方法检测两组小鼠每个胰腺 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、 TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-5、IL-10、IL-15、TGF-β、B
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R285

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