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Cyclin D3与eIF3k的相互作用及TH1与A-Raf相互作用的研究

沈晓云  
【摘要】:在细胞周期的调控过程中,有两大家族的蛋白发挥着重要的作用。一个家族是CDK,它们磷酸化特异的蛋白来调节下游通路。另一个家族是专门的调节蛋白cyclins,它们与CDK分子结合来调节CDK的激酶活性。当细胞从静止期进入细胞分裂时,编码D型cyclin的基因在G1期被激活,cyclin D随之与CDK4或CDK6形成一个复合物,活化后的激酶复合物磷酸化底物蛋白调控下游的通路。 在cyclin D中,cyclin D3不仅作为一个CDK4和CDK6的调节亚基在G1期调节细胞周期进程,还与细胞生长、细胞分化、转录调节和凋亡有关。我们实验室报导了一个G2/M期的CDK-CDK11P58,也能特异地与cyclin D3在G2/M期相互作用。为了进一步了解cyclin D3在细胞里的功能,我们以cyclin D3为诱饵蛋白,用酵母双杂交技术筛选人胎肝cDNA文库,找到了与cyclin D3结合的蛋白eIF3k(真核翻译起始因子3的p28亚基)。Cyclin D3与eIF3k的相互作用是特异性的,因为我们没有检测到eIF3k与其它cyclin D的相互作用。我们构建了cyclin D3的缺失突变体,用酵母双杂交的方法明确了cyclin D3与eIF3k相互结合所需的区域位于cyclin D3的第154-292氨基酸之间,这一区域是cyclin D同源性最低的部位。我们进一步用体外结合实验、体内的免疫共沉淀和激光共聚焦确定了cyclin D3和eIF3k的相互作用。激光共聚焦显微镜观察发现eIF3k分布于细胞质和细胞核中,cyclin D3与eIF3k在细胞内不仅具有共定位,而且过表达cyclin D3会影响eIF3k在细胞中的分布,使更多的eIF3k蛋白集中在细胞核中。过表达eIF3k会抑制细胞的翻译活性,而过表达cyclin D3则会增强细胞的翻译活性,同时转录水平不受影响。这为我们进一步理解cyclin D3和eIF3k在细胞中可能的的功能提供了有益的线索。 细胞通过信号传导通路将来自细胞外各种刺激传导入细胞核内,调节基因的表达,从而使细胞产生增殖、分化、凋亡等生命活动。MAP kinase (mitogen activated protein kinase)传导通路是细胞完成各种生命活动最基本的信号系统之一。其基本组成是一个三级激酶级联反应,包括MKKKs (mitogen activated protein kinase kinase kinases),MKKs (mitogen activated protein kinase kinases),和MAPKs。Ras/Raf/MEK/ERK通路是其中最基本、研究最多的信号通路。这一传导通路主要与控制细胞生长有关,包括对细胞增殖、转化、分化及凋亡的调控。Raf家族有三个异构体:A-Raf,B-Raf和c-Raf(Raf-1)。它们在结构上很保守,但越来越多的实验表明,它们在功能上并不是冗余的,而是各有其特异的 WP=4 生物学活性。 在我们实验室以前的的工作中,采用酵母双杂交的方法,以A-Raf为诱饵蛋白筛选了人胎肝cDNA文库,发现了一个与A-Raf相互作用的蛋白trihydrophobin 1(TH1)。TH1是2000年克隆的一个新基因,对于它的功能方面还没有研究。本实验中对TH1与A-Raf的相互作用进行了进一步的研究。在GST pull-down 实验中验证了TH1与A-Raf的相互作用,并通过酵母共转化和GST pull-down发现TH1蛋白N端1-392氨基酸的区域对于这种结合是至关重要的。激光共聚焦显微镜观察也证实了TH1与A-Raf在细胞内的共定位。我们的实验还表明TH1与A-Raf的相互作用是特异性的,因为TH1与Raf家族的另两个成员B-Raf和c-Raf不能相互作用。另外,激光共聚焦结果显示,TH1和A-Raf的相互作用并不仅仅局限于细胞质和细胞膜上,而通过对TH1蛋白结构域分析,我们发现其似乎不具有激酶结构域,推测有可能是一种新的构架蛋白。这些研究有助于对TH1和A-Raf作用的功能和机制有进一步的认识和理解。


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