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《复旦大学》 2005年
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PEDF基因修饰色素上皮细胞对脉络膜新生血管作用的体外研究

汪枫桦  
【摘要】:目的:分离、培养和纯化原代视网膜(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较RPE与IPE的生物学特性。分离和培养原代脉络膜毛细血管内皮细胞(CEC),建立脉络膜新生血管体外模型。通过体外实验的方法研究色素上皮源性因子(PEDF)及PEDF基因修饰的色素上皮细胞对脉络膜新生血管的作用。 材料和方法:采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE细胞,进行体外培养,密度梯度离心法纯化,免疫组化的方法进行鉴定。观察比较RPE、IPE细胞的超微结构、生长状况,RT-PCR方法检测与RPE功能密切相关的几种蛋白质mRNA的表达。采用磁分选技术分离培养原代的脉络膜毛细血管内皮细胞,用Ⅳ型胶原铺板,诱导细胞分化、连接形成血管样结构。用脂质体介导基因转染法将人PEDF基因导入体外培养的虹膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞,利用质粒包含的抗稻瘟菌素的耐药性基因筛选稳定表达PEDF的色素上皮细胞株。RT-PCR鉴定PEDF在细胞内的表达;ELISA方法检测细胞分泌PEDF的水平。采用CulLure Insert共培养PEDF基因修饰的色素上皮细胞和CEC细胞,观察PEDF对有或无血管内皮生长因子(VEGF)刺激条件下CEC的增生、移行和血管样结构的形成的影响效应;ELISA方法检测共培养细胞上清液中VEGF浓度。 结果:纯化后体外培养牛RPE细胞和IPE细胞的角蛋白表达强阳性。原代培养的牛RPE、IPE细胞外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量的色素颗粒、内质网,RPE细胞还含有许多与其吞噬功能相适应的溶酶体。RT-PCR显示RPE和IPE细胞均有视黄醛结合蛋白(CRALBP)、维生素A结合蛋白(RBP)、11-顺视黄醛脱氢酶(11-cis RDH)和组织蛋白酶D(CathepsinD)的mRNA表达。采用CD31抗体包被的磁珠分离培养的细胞在特殊培养基下生长良好,V-W因子表达阳性,证实为毛细血管内皮细胞。在Ⅳ型胶原的诱导下,细胞生长逐渐形成血管样结构。浓度100ng/mL~1000ng/mL PEDF对20ng/mL的VEGF刺激下CEC细胞的增生、移行有抑制作用(P0.05),加入PEDF抗体后,能够阻断其抑制作用。PEDF基因
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R773.4

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