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马蹄莲、石斛和姜凝集素基因的克隆及分析

陈中海  
【摘要】:凝集素是一类含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质。单子叶植物甘露糖结合型凝集素(monocot mannose-binding agglutinins)是其中比较大的一个家族,其中以雪花莲凝集素为代表的一个亚类显示出良好的抗同翅目昆虫活性,以天麻抗真菌蛋白为代表的另一亚类则具有突出的抗真菌活性,它们在植物抗虫和抗病基因工程中均具有很大的应用潜力。 为了挖掘更多更有效的抗病、抗虫基因,本文对植物凝集素基因进行研究,以马蹄莲、石斛和姜为材料,利用RACE-PCR技术,成功地从中克隆出了凝集素基因,并对其功能进行了研究,得到如下结果: 1.首次从天南星科植物马蹄莲中克隆了马蹄莲凝集素基因zaa,zaa的全长cDNA为871bp,含有一个417bp的开放阅读框,编码一个由138个氨基酸组成的前体蛋白。对ZAA和其他单子叶甘露糖结合凝集素的序列同源性进行了比较,并发现zaa是由一个多基因家族编码的。半定量RT-PCR表明zaa在马蹄莲植物的各个部位都有表达,其中在叶柄中的表达量最高。 2.克隆了马蹄莲凝集素基因的包含启动子区、终止子区和全长基因组序列,并对其启动子区基本活性元件和抗病相关的元件以及其它的元件进行了预测。启动子区具有核心启动子,终止子富含A+T序列,形成发夹结构,具备终止子的特征。 3.构建了zaa基因的植物表达载体pCAMBIA1304—zaa并导入到根癌农杆菌EHA105中,对烟草进行了转化。 4.从兰科植物铁皮石斛中克隆了石斛凝集素基因doa1和doa2,doa1的全长cDNA为768bp,含有一个498bp的开放阅读框,编码165个氨基酸;doa2的全长cDNA为777bp,含有一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸。 5.首次从姜科植物姜中克隆了姜凝集素基因zoa,姜凝集素基因的全长为768bp,含有一个510bp的开放阅读框,编码169个氨基酸。分析表明,姜凝集素属于单子叶甘露糖结合的凝集素,该研究不仅把这一家族凝集素(甘露糖结合凝集素)延伸到了姜科,而且有助于进一步研究凝集素的进化关系。 6.分别构建了含aha(天南星凝集素)、doa2和zoa基因的原核表达载体,并成功地实现了这三个基因在E.coli中的表达,并对其重组的蛋白进行了纯化。从植物中提取了天然的AHA和ZOA,作为对照进行了凝血活性实验。结果表明重组AHA和ZOA具有和天然蛋白一样的凝血活性。抑菌实验表明,重组DOA2和ZOA能明显抑制小麦赤霉病菌的生长。 马蹄莲、石斛和姜凝集素基因的克隆为深入研究其抗病虫害功能打下了基础,该研究对获得更多具有自主知识产权的功能基因、为利用基因工程技术改良农作物抗病


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