乌拉尔甘草遗传多样性与品质评价及槲寄生的抗氧化活性成分

【摘要】： 本论文包括以下两部分研究内容：(1)乌拉尔甘草的遗传多样性及品质评价；(2)槲寄生抗氧化活性成分研究。 第一部分对中国华北产乌拉尔甘草的遗传多样性及其药材质量进行了系统深入的研究。乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch．)为豆科甘草属多年生草本植物，是我国药用甘草的主要来源，同时也是维护我国西北部荒漠半荒漠地区生态环境的重要固沙植物。甘草药材的用途非常广泛，除药用外，还广泛应用于食品、烟草、化妆品等行业。该植物在我国北方分布广泛，从新疆的西部边陲一直延伸到黑龙江东部。近年来，由于国内外甘草市场需求量猛增，野生资源的过度采挖不仅导致甘草药材产量和质量的急剧下降，同时也加速了我国北方荒漠化的扩展，造成了严重生态灾难。另一方面，乌拉尔甘草的地理分布跨度大，形态变异十分显著，药材质量差异也很大。然而迄今为止，有关这一广布种的种下遗传变异、居群结构、地理分布格局及其与药材质量的相关性未见系统研究报道。开展本课题的研究具有重要的科学意义和应用价值。 对内蒙古、宁夏、甘肃、陕西、山西、河北、吉林、黑龙江共八省区的野生乌拉尔甘草资源进行了系统深入的实地考察和样品采集，采集到30个产地居群单株样本共计300余份，其中每份材料均包括嫩叶和药用部位，分别供遗传多样性分析和药材质量评价研究。实地考察结果显示由于连年过度采挖，野生乌拉尔甘草的生境已严重破碎化，在上述地区已很难采挖到粗大主根，90％以上的居群均只能找到细小的次生根或根茎，即俗称的“毛草”。野生乌拉尔甘草的生境、资源储藏量及药材质量十分令人担忧。 应用ISSR分子标记方法对内蒙古、宁夏、甘肃及陕西四省区共12个野生乌拉尔甘草居群的遗传多样性进行了分析。利用筛选出的14条ISSR引物，从12个居群232份样品中共扩增出287条条带，其中多态带数236条，多态带百分率为98.61％。居群遗传多样性分析结果显示，乌拉尔甘草在物种水平上，总的遗传多样性指数(h)和香农指数(I)分别为0.304和0.463；在居群水平上分别为0.181和0.276，在地区水平上，内蒙古最高，分别为0.285和0.436，甘肃最低，分别为0.213和0.327；全部12个居群的遗传分化系数(Gst)和基因流(Nm)分别为0.166和1.236；在地区水平上，陕西居群的遗传分化系数显著高于其它三个地区，为0.518，同样陕西居群的Nm明显低于其它三个地区，为0.464。AMOVA分析结果表明：乌拉尔甘草12个居群有60.39％的遗传变异发生在居群内，39.61％的遗传变异发生在居群间。依据Nei遗传距离对不同种群进行UPGMA聚类，结果显示内蒙古的四个居群(SH，EJ，BL和BY)及宁夏的三个居群(ME，GS和DM)分别构成两个单系分支，遗传关系较近：而内蒙古磴口居群(DK)与内蒙古其它居群遗传关系较远，甘肃的两个居群(LC和HC)及陕西的二个居群(WO和DB)均相互独立，遗传分化明显。本实验结果显示乌拉尔甘草依然保留着较高的遗传多样性水平，为其种质资源的保存、保护及抚育提供了科学依据。 应用ISSR分子标记方法对产自内蒙、宁夏、甘肃、陕西、山西、河北、吉林、黑龙江的30个产地居群共计139余样本的遗传变异及其亲缘关系进行了研究。基于Nei距离系数的UPGMA聚类结果显示，中国华北及东北所产乌拉尔甘草明显划分为3个主要分支：内蒙磴口居群的5份样品(DK01—05)与其它产地居群亲缘关系较远，而且5份样品形成4个单系分支，其支持率均在60％以上，充分显示了该居群甘草遗传分化的显著性及特殊性；内蒙杭锦旗巴彦乌苏居群(BY)、内蒙鄂托克前旗三个居群(SH、EJ和BL)、宁夏盐池三个居群(GS、ME和DM)及陕西定边居群(DB)的亲缘关系较近，形成一个单系分支(GroupB)；其它居群形成一个单系分支(Group A)，Group A与B构成分支的支持率为46％。研究发现GroupB集中分布于鄂尔多斯高原之毛乌素沙漠及库布齐沙漠地带，传统上属于“梁外草”的产地范畴；而Group A主要属于“东草”产地范畴，其生境主要为丘陵及山地，植被较茂盛、土壤、水分及空气湿度较大；磴口居群集中分布于黄河西岸，传统上属于“王爷甘草”产地范围，地理隔离及特殊生境共同决定了其遗传分化。以上事实说明乌拉尔甘草的遗传变异可能是由于不同的种群适应不同的生态环境而趋异的结果，并且揭示了“梁外草”、“王爷草”及“东草”不仅是一个产地区域概念，而且也是代表不同遗传分化的品种概念。本结果首次揭示了乌拉尔甘草的种内变异规律，并为甘草药材的品种划分提供了科学依据。 应用HPLC法分别测定了内蒙古、宁夏、甘肃、陕西等八省区30个不同产地共116份乌拉尔甘草药材样品中的甘草酸、甘草苷和异甘草苷的含量。结果显示：在所测定的样本中，甘草酸含量达到2005年版药典标准(＞2.0％)的仅占15.5％；甘草苷含量达到标准(＞1.0％)的仅占11.2％；甘草酸及甘草苷同时达到药典标准的仅占9.5％。这一结果充分反映了目前我国野生甘草资源质量所面临的严峻形势!不同产地的乌拉尔甘草样品所含甘草苷、异甘草苷和甘草酸含量有着显著的差异，其中甘草苷和甘草酸含量达到2005版药典标准的样品中，质量较高者产自甘肃合水；在未达药典标准的样品中，甘草苷和甘草酸含量均较低的是产自内蒙古鄂托克前旗上海庙的样品。 综合遗传多样性和化学成分含量测定结果，发现甘草苷含量大于1％的样品均分布于Group A中，甘草酸含量大于2％的样品除了两个样品分布于Group B中外，其余也均分布于GroupA中，同时满足甘草苷含量大于1％，甘草酸含量大于2％的样品均分布于Group A中。Group A中甘草苷和甘草酸平均值分别为0.61％和1.53％，Group B中分别为0.24％和1.13％，内蒙古磴口居群5份样品含甘草苷和甘草酸分别为0.18％和0.82％。这说明乌拉尔甘草中甘草酸及甘草苷的含量与遗传变异有一定相关性。 第二部分研究了槲寄生的化学成分及其抗氧化活性。槲寄生为桑寄生科植物槲寄生Viscum coloratum(Kom．)Nakai的干燥带叶茎枝，常寄生于梨、榆、杨、山楂等树上，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿、滋阴养血的功效。植物化学研究揭示槲寄生中富含黄酮类化合物，药理学研究表明槲寄生具有抗衰老和抗氧化作用。我们对槲寄生黄酮类化学成分进行了较为系统的研究，以期阐明其抗氧化药效物质基础，为其药材质量标准的建立提供科学依据。 采用大孔吸附树脂、Sephadex LH-20等柱色谱方法从槲寄生的40％乙醇部位分离得到6个化合物，应用UV、IR、NMR、MS、CD等方法鉴定其结构分别为：高圣草素-7-O-B-D-葡萄糖苷(Ⅰ)，北美圣草素-7-O-B-D-葡萄糖苷(Ⅱ)，柚皮素-7-O-B-D-葡萄糖苷(Ⅲ)，(2S)-高圣草素-7，4′-O-β-D-双葡萄糖苷(Ⅳ)，(2R)-北美圣草素-7，4′-O-β-D-双葡萄糖苷(Ⅴ)和1，7-二-对羟基苯-5-羟基-顺式-2，3-环氧-1-庚酮(Ⅵ)。其中化合物Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ为新化合物，除化合物Ⅰ外，其余化合物均为首次从该植物中分离得到。 随后，分别采用化学比色法和电子顺磁共振法(EPR)对上述化合物的抗氧化活性进行了深入系统的研究。化学比色法的结果显示化合物Ⅰ-Ⅵ对羟自由基和超氧阴离子自由基均有较好的清除作用。在清除羟自由基(·OH)的反应中，化合物Ⅵ的自由基清除率最强，其IC_(50)值为0.17 mM；在清除超氧阴离子自由基(O_2~-·)的反应中，化合物Ⅲ的自由基清除率最弱，其IC_(50)值为0.49 mM，所有化合物对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用均强于对照茶多酚(EGCG)(其IC_(50)值分别为0.58 mM和0.53 mM)。电子顺磁共振法的结果同样显示这些化合物对羟自由基和超氧阴离子自由基有不同程度的清除作用。在EPR-羟自由基清除反应中，化合物Ⅳ自由基清除率最强，IC_(50)值为0.23 mM，优于阳性对照茶多酚(IC_(50)值为0.54 mM)；在EPR-超氧阴离子清除反应中，化合物Ⅵ的自由基清除率最弱，其IC_(50)值(0.27 mM)略高于茶多酚(IC_(50)值为0.12 mM)。同时实验结果还提示这些化合物抗氧化活性的强弱与化合物的水溶性，分子结构中苯环上羟基、甲氧基的数目和取代位置等有关。 本论文的主要成果及创新点如下： 1．首次应用ISSR技术对野生乌拉尔甘草的居群遗传多样性进行了系统研究，发现该种群遗传多样性水平依然很高，提示尽管采挖过度，还不至于导致该种群遗传多样性的丧失而灭绝，因此只要有效采取就地保护和抚育措施，4—5年后我国野生甘草药材的产量和质量均有望得到恢复，这一研究结果为野生乌拉尔甘草资源的保护和抚育，以及我国北方荒漠地区的生态保护、恢复和重建，提供了科学依据。 2．首次应用ISSR技术，对内蒙古、宁夏、吉林、黑龙江等八省区所产乌拉尔甘草的遗传变异进行了系统研究，发现该种群存在明显的遗传分化变异，并首次揭示了遗传变异与产地环境，以及药材质量的相关性，为甘草药材质量的评价及优良品种的选育提供了科学依据。 3．通过内蒙古、宁夏、吉林、黑龙江等八省区野生乌拉尔甘草产地的实地考察，结合采用HPLC方法对116份甘草药材样品中甘草苷、异甘草苷及甘草酸的含量测定，发现这些甘草的传统产地目前所能获得的甘草药材，90％以上达不到药典标准。这是迄今为止有关国产甘草野生资源质量的最新研究结果。 4．从槲寄生中分离鉴定了五个黄酮类化合物和一个二芳基庚酮类化合物，其中3个新化合物，并发现它们具有显著的抗氧化活性，对阐明槲寄生的活性物质基础及评价药材质量具有积极意义。

【关键词】：乌拉尔甘草 居群 ISSR 遗传多样性 质量评价 种质资源 槲寄生 黄酮苷 抗氧化活性
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R282
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